با آب دیونیزه به 100 رساندیم، در دو فلاسک 250 میلی لیتری تقسیم و اتوکلاو نمودیم. قبل از استفاده، به محلول، 5/0 میلی لیتر MgCl2 استریل با غلظت 2 مولار اضافه کردیم. محلول گلیسرول 50 درصد را پس از آماده کردن جهت استریل سازی اتوکلاو نموده و در دمای 4 درجه نگهداری کردیم. هم چنین غلظت نهایی گلیسرول در محلول به میزان 15 درصد رسانده شد. محلول CaCl2 با غلظت 50 میلی مولار را از طریق یک فیلتر 2/0 میکرومتری استریل نموده و درون یک محفظه استریل نگهداری کردیم.
روش آماده سازی سلول های پذیرا
روی محیط کشت LB Agar بدون آنتی بیوتیک تهیه شده از قبل سلول های ای کلای BL21 DE3 را استریک کرده و سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب انکوبه شد. یک کلونی را از روی پلیت به داخل 10 میلی لیتر محیط کشت استریل وارد کرده و به مدت یک شب در دمای 37 درجه روی انکوباتور شیکردار با 200 دور بر دقیقه انکوبه کردیم. یک میلی لیتر از این محیط را به 50 میلی لیتر از محیط کشت SOB اضافه گردید و در دمای 37 درجه روی انکوباتور شیکردار با 200 دور بر دقیقه انکوبه شد تا زمانی که جذب در 600 نانومتر به 5/0 رسید. سپس سلول ها توسط سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در چهار درجه سانتی گراد با 5000 دور بر دقیقه رسوب داده شد. رسوب سلولی خیلی آرام در 50 میکرو لیتر CaCl2 سرده شده احیا گردید و به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار داده شد. سلول ها مثل قبل رسوب داده شدند و با 2 میلی لیتر CaCl2 در حضور سرما به آرامی احیا شدند و سلول ها روی یخ نگهداشته شدند. گلیسرول 50 درصد به سلو ل ها اضافه شد و به آرامی مخلوط گردید. به میزان 100 میکرولیتر داخل میکروتیوپ تقسیم شد و در دمای 70- درجه سانتی گراد ذخیره گردید.
3-3-2-2- ترانسفورماسیون سلول های پذیرا
محلول های مورد نیاز
محلول های مورد نیاز برای ترانسفورماسیون شامل آماده سازی محیط کشت LB broth بدون آنتی بیوتیک و پلیت های LB agar حاوی مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک می باشد.
روش ترانسفورماسیون
داخل اپندورف تیوپ های 5/1 میلی لیتری استریل به میزان 50 میکرولیتر از سلول های پذیرا ریخته شد پس از اضافه نمودن 4 میکرولیتر پلاسمید تخلیص شده (پلاسمیدها به روش مینی پرپ استخراج شده بودند) به آرامی مخلوط گردید و سپس به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شد. از دمای 42 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه به منظور ایجاد شوک حرارتی استفاده گردید. نمونه ها به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. به میزان 300 میکرولیتر LB broth بدون آنتی بیوتیک به مخلوط اضافه نموده و به مدت 45 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد و داخل انکوباتور شیکردار انکوباسیون را انجام دادیم. سلول هارا داخل پلیت های LB agar حاوی مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک به صورت زیر تقسیم شدند. پلیت A شامل سلول های پذیرای حاوی پلاسمید و آنتی بیوتیک مناسب. پلیت B شامل سلول های پذیرا و آنتی بیوتیک. پلیت Cشامل سلول های پذیرا و آگار فاقد آنتی بیوتیک. سرانجام در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت یک شب انکوباسیون صورت گرفت. اگر کار درست انجام شده باشد باید روی پلیت های A و C کلنی باکتری رشد کرده باشد ولی روی پلیت B کلنی باکتری مشاهده نگردد. کلنی های باکتریایی که روی پلیت A رشد می کنند حاوی کلنی های حاوی پلاسمید مورد نظر هستند (شکل 34).
شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون.
3-3-2-3- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد
از کلنی های ترانسفورم شده، یک کلنی مناسب انتخاب می شود و داخل 3 میلی لیتر از محیط کشت LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود انکوبه گردید و تقریبأ به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و داخل انکوباتور شیکردار با دور rpm 200 رشد داده شد. سپس به منظور ساب کالچر به میزان 5/0 میلی لیتر از کالچرهای رشد داده شده به داخل 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود منتقل گردید و به مدت یک شب در همان شرایط داخل انکوباتور شیکردار قرار گرفت. بعد از این مرحله سلول ها به مدت 10 دقیقه درون سانتریفیوژ با دور rpm5000 گذاشته شدند. سپس رسوب های سلولی حاصل با 1 میلی لیتر از LB تازه بدون آنتی بیوتیک احیا گردیدند و پس از آن به 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود جهت ساب کالچر انتقال داده شدند. این مرحله تا زمانی که جذب در 600 نانومتر به حدود 1/0 برسد ادامه یافت. از باقیمانده ی رسوب سلولی نیز جهت استخراج پلاسمید در فریزر نگهداری شد. درادامه به منظور رشد بیشتر کالچرها در دمای 37 درجه داخل انکوباتور شیکردار قرار داده شدند تا زمانی که جذب در 600 نانومتر برابر 6/0تا 7/0 شد. به این مرحله فاز رشد لگاریتمی میگویند. سپس از هر کالچر به میزان 500 میکرولیتر داخل میکروتیوپ استریل ریخته شد و در دمای 20- درجه سانتی گراد به منظور نمونه قبل از القا جهت آنالیز SDS-PAGE ذخیره شد. هم چنین به میزان 700 میکرولیتر از کالچر قبل از القا با 300 میکرولیتر ازگلیسرول 50 درصد مخلوط گردید واستوک حاصل با 15 درصد گلیسرول در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. سپس القای بیان پروتئین ها با اضافه نمودن IPTG به میزان 1 میلی مولار صورت گرفت. پس از هر ساعت که از زمان القای بیان پروتئین گذشت به منظورجمع آوری نمونه بعد از القا جهت آنالیز SDS-PAGE براساس حجم نمونه ی جمع آوری شده در مرحله قبل از القای بیان پروتئین، نرمالایز صورت گرفت. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در سانتریفوژ با دور rpm 5000 قرارگرفتند و سرانجام رسوب سلولی حاصل جهت آنالیز SDS-PAGE برای بررسی پروتئین تولید شده مورد استفاده قرار گرفتند.
3-3-2-4- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد
جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده پس از القا، در نهایت به مدت 10 دقیقه کالچرها در سانتریفیوژ با دور rpm 5000 قرار داده شد و رسوب سلولی حاصل با اضافه نمودن 10 میلی لیتر بافر لیز سلولی احیا گردید و سپس سلول ها به مدت 2 دقیقه با استفاده از سونیکاتور که روی شرایط 20 ثانیه روشن و 20 ثانیه خاموش و بالاترین ولتاژ تنظیم شده بود سونیکیت گردیده و لیز شدند. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت سلولی حاصل به میزان 100 میکرولیتر به عنوان لایزت کل سلولی جمع آوری شد و همچنین به مدت 20 دقیقه باقیمانده ی لایزت را در سانتریفیوژ با دور rpm12500 قرارداده شد. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت شفاف (soluble fractions) به میزان 20 میکرولیتر جمع آوری و نگهداری شد.
3-3-2-5- روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین
هر نمونه با 40 میکرولیتر آب دیونیزه و60 میکرولیتراز بافرنمونه مخلوط شدند.سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و همچنین به مدت 15 دقیقه با حداکثر دور سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ به میزان 20 میکرولیتر از سوپرناتانت هر نمونه درون چاهک های ژل با گرادیان غلظتی 4 تا 12 درصد از پلی آکریل آمید ریخته شد و هم چنین مارکر وزن مولکولی نیز درون یک چاهک قرار گرفت. جهت الکتروفرز ولتاژی برابر با ولت 200 به مدت 35 دقیقه درون میزان مناسبی از بافر الکترود برقرار شد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با بافر رنگ آمیزی به مدت 35 دقیقه رنگ می شود و درآخر با بافر رنگ بر به مدت 30 دقیقه رنگ زدایی صورت می گیرد.
شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین.
3-3-2-6- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد
در آنالیز SDS-PAGE جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد نمونه ی لایزت کل سلولی با سوپرناتانت لایزت شفاف مقایسه گردید. از آنجا که در این دما پروتئین محلول نبود با تغییر شرایط آزمایش به صورت کاهش دمای رشد باکتری از 37 درجه به 20 درجه سانتیگراد القای تولید پروتئین صورت گرفت. در این روش پس از کشت اولیه و رسیدن به زمانیکه جذب در 600 نانومتر برابر با 6/0تا 7/0 بود کالچرها به مدت 1 ساعت در دمای 20 درجه سانتیگراد درون شیکر انکوباتور یخچال دار قرار داده شدند، هم چنین به منظور آنالیز SDS-PAGE به میزان 100 میکرولیتر نمونه تحت عنوان قبل از القا جمع آوری گردید. سپس به میزان 1 میلی مولار IPTG جهت القا به محیط کشت افزوده شد و به مدت یک شب در دمای 20 درجه سانتیگراد در انکوباتور یخچال دار قرار داده شد. پس از تایید محلول شدن در دمای 20 درجه سانتیگراد، پروتئین به میزان 1 لیتر تولید گردید و در نهایت رسوب سلولی حاصل جهت تخلیص پروتئین جمع آوری گردید.
3-3-2-7- تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی
رسوب سلولی حاصل در 30 میلی لیتر بافر لیز کننده احیا گردید و سونیکیت شد. سپس به مدت 1 ساعت داخل سانتریفیوژ با دور rpm 13500 در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سانتریفیوژ، سوپرناتانت شفاف جمع آوری شد و جهت خالص سازی پروتئین در ستون حاوی 5 میلی لیتر از NTA – 2+ Ni ریخته شد. سپس ستون با یک گرادیان غلظتی افزایشی از ایمیدازول 50، 75، 100، 150 و 200 میلی مولار شسته شد. پروتئین سرانجام در غلظت 75 میلی مولار از ستون خارج گردید. میزان خلوص پروتئین مد نظر توسط آنالیز SDS-PAGE ارزیابی گردید. فرکشن های حاوی پروتئین هدف با هم ترکیب شده و به مدت 6 ساعت در 4 لیتر از بافر دیالیز قرار گرفت. نمونه دیالیز شده با آنالیز SDS-PAGE بررسی گردید.
شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی.
3-3-3- تعیین غلظت پروتئین
با استفاده از دستگاه نانو درآپ غلظت پروتئین اندازه گیری شد. قبل از اندازه گیری، سیستم با استفاده از یک محلول بلانک (2 میکرولیتر از بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7) صفرشد. در این محاسبه وزن مولکولی پروتئین به میزان 38 کیلو دالتون اعمال شد.
3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس
برای بررسی ساختار سوم پروتئین تخلیص شده در شرایط متفاوت از روش فلوئورسانس ذاتی استفاده شد. انداره گیری شدت فلوئورسانس ذاتی با دستگاه اسپکتروفلوریمتر واریان کری اکلیپس مدل Bio 700، حاوی کووت کوارتز با طول مسیر 10 میلی متر صورت گرفت. آشکارساز (PMT)روی ولتاژ متوسط تنظیم شد. هر یک از دو شکاف های تحریکی و انتشاری با یک باند پاس 5 نانومتر استفاده شد. طول موج تحریک پروتئین 280 نانومتر بود و داده ها در دمای اتاق و طول موج نشری 300 تا 450 نانومتر جمع آوری شدند. به منظور از بین بردن اثر پس زمینه ی بافر حاوی پروتئین روی شدت فلوئورسانس، سیستم با استفاده از یک محلول بلانک (400 میکرولیتر از بافر) صفر شد.
پروتئین با غلظت 3 میلی گرم بر میلی لیتر در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 تهیه شد. غلظت پروتئین در همه ی محلول های مورد آزمایش ثابت نگه داشته شد. به میزان 15 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل کووت 400 میکرولیتری ریخته و با بافر به حجم نهایی رساندیم. به منظور بررسی اثر فلزات سمی روی شدت فلوئورسانس پروتئین، چندین محلول حاوی غلظت های ثابت از پروتئین در حضور غلظت های متفاوت از محدوده ی 100 میکرومولار تا 1000میکرومولار از کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب و نیترات نیکل و اثر هرکدام در شرایط نرمال بررسی گردید. هم چنین با اضافه کردن میزان مناسبی از بافر به هر نمونه، حجم نهایی محلول به میزان 400 میکرولیتر نگه داشته شد. سپس طیف نشری بعد از گذشت زمان اینکوبیشن به مدت 30 دقیقه

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه ارشد با موضوع دمائی، AShREA، دماهایی، آید: