پذیر به هم مرتبط می شوند، همچنین خود این اتصال دهنده ها ممکن است در عملکرد پروتئین دارای نقش مهمی باشند. به طور کلی پیچیدگی فرآیند آنفولدینگ در پروتئین هایی که بیش از یک دومین دارند دیده می شود. این پیچیدگی به این دلیل است که هر دومین می تواند به طور مستقل از دومین دیگر آنفولد شود. برای مطالعه ی دناتوراسیون و فولدینگ مولتی دومین پروتئین ها تکنیک های متفاوتی وجود دارد. طیف سنجی فلوئورسانس یک ابزار قابل اعتماد در مطالعه ی پروتئین هاست. این روش حساسیت و انتخاب پذیری بالایی دارد. تکنیک های دیگر شامل دورنگ نمایی حلقوی و روش پراکنـدگی دینامیـکی نور  (DLS) و غیره می باشند (122-121).
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی
برای اولین بار فلوئورسانس در اواسط قرن 19 توسط سرجان فردریک ویلیام هرشل مطرح شد. فلوئورسانس در واقع شکل ویژه ای از لومینه سانس است. مشخصه ی آن آزاد شدن یک فوتون از مولکولی است که در حین انتقال از حالت برانگیخته به حالت پایه می رسد. این آزاد شدن انرژی با سرعتی معادل با s-1 108 رخ می دهد. انواع فرآیند های فعال و غیرفعال سازی فلوئورسانس در شکل 28 که دیاگرام جابلونسکی (Jablonski Diagram) گفته می شود، نشان داده شده است (این دیاگرام حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها را نشان می دهد).
مراحل اصلی ذکر شده در نمودار به تفصیل در زیر آمده است:
مرحله ی جذب :(Absorption) جذب با تحریک بسیار سریع اتفاق می افتد ( 15-10 ثانیه). انتقالات جذبی از حالت پایه ارتعاشی در تراز الکترونی یکتایی پایه (S0) به ترازهای مختلف ارتعاشی در اولین و دومین حالت الکترونی برانگیخته ( S2و (S1 در شکل نشان داده شده است.
مرحله ی آسایش ارتعاشی :(Vibrational Relaxation) این فرآیند نوعی آسایش غیرتابشی است. ملکول های موجود در حالت های ارتعاشی برانگیخته به سرعت انرژی اضافی ارتعاشی خود را از دست داده و به سطح ارتعاشی پایه در تراز الکترونی مربوطه می روند. انرژی در این حالت به صورت گرمایی یا حرکات ارتعاشی مولکول های حلال از دست می رود. به طور طبیعی آسایش ارتعاشی به صورت گام به گام اتفاق می افتد و شرط انتقال از تراز ابتدایی (νi) به تراز نهایی (νf) رابطه Δν=1 می باشد. این بدان مفهوم است که براثر هر برخورد ملکول با ملکول های حلال، که منجر به غیرفعالسازی غیرتابشی می شود، مولکول برانگیخته یک کوانتوم انرژی ارتعاشی خود را از دست داده و صرفا انتقال به یک تراز انرژی پایین تر در مرحله رخ می دهد. مدت زمان انجام این فرایند 10-10 تا 11-10 ثانیه می باشد.
مرحله ی تبدیل درونی :(Internal Conversion) انتقال الکترون بین دو تراز الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است که به شیوه غیرتابشی صورت می گیرد. شرط انجام این فرآیند همپوشانی نمودارهای انرژی پتانسیل دو تراز الکترونی است، به نحوی که انرژی حالت ارتعاشی پایین تر تراز الکترونی بالاتر و حالت ارتعاشی بالاتر تراز الکترونی پایین تر با هم برابر باشد. این فرآیند می تواند بین دو حالت برانگیخته رخ دهد (S2→S1) و یا بین اولین حالت الکترونی برانگیخته و حالت الکترونی پایه (S1→S0) اتفاق بیافتد. مدت زمان انجام این فرآیند بین حالت های الکترونی برانگیخته، 12-10 ثانیه است. تبدیل درونی از یک حالت برانگیخته الکترونی به حالت الکترونی پایه (S→S0) وابسته به نوع ملکول بوده ولی معمولا در صورتی که تفاوت انرژی زیادی بین S و S0 وجود داشته باشد، کارایی کمتری دارد. بنابراین هیچ گونه هم پوشانی بین چاه های انرژی پتانسیل دو حالت وجود نخواهد داشت. بعد از تبدیل درونی، انرژی اضافی به سرعت از دست رفته و مولکول در پایین ترین سطح ارتعاشی حالت الکترونی پایین تر قرار می گیرد.
مرحله ی فلوئورسانس: انتقال تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است. در مورد بیشتر مولکول ها، الکترون ها در حالت پایه جفت می شوند(با اسپین های مخالف)، بنابراین فلوئورسانس شامل یک انتقال یکتایی-یکتایی است. با توجه به این که تبدیل درونی به تراز S و آسایش ارتعاشی بعد از آن بسیار سریعتر از فلوئورسانس است، فلوئورسانس معمولا از پایین ترین تراز ارتعاشی S به حالت های ارتعاشی مختلف در تراز الکترونی پایه صورت می گیرد. بنابراین حتی اگر جذب به حالت های مختلف یکتایی برانگیخته صورت گرفته باشد تنها یک باند فلوئورسانس دیده می شود. به طور معمول مدت زمان فلوئورسانس 6- 10 ثانیه است. باندهای فلوئورسانس مولکولی عمدتا از خطوطی تشکیل شده که طول موج بلندتر یا فرکانس کمتری (انرژی کمتر) نسبت به باند جذبی خود دارند. شیفت به طول موج های بلندتر، شیفت استوک (Stokes Shift) نیز خوانده می شود.
مرحله ی تبدیل بیرونی :(External Conversion) نوعی آسایش غیرتابشی است که در آن حالت های برانگیخته انرژی اضافی خود را به سایر گونه ها (مثل حلال یا مولکول های حل شونده) می دهند. یکی از مکانیزم های تبدیل بیرونی، خاموشی برخوردی یا دینامیک (Dynamic or Collisional Quenching) است. در این نوع خاموشی، طی برخورد انرژی از گونه برانگیخته به سایر مولکول ها منتقل می شود. بنابراین سرعت خاموشی دینامیک با سرد کردن نمونه کاهش می یابد.
مرحله ی عبور بین سیستمی :(Intersystem Crossing) انتقالات جذبی از حالت های یک تایی به سه تایی ممنوع است. هر چند جذب ضعیفی در مورد برخی مولکول ها امکان پذیر است. تراز برانگیخته سه تایی همچنین می تواند از طریق انتقال الکترون از ترازهای یکتایی برانگیخته پر شود. به این فرآیند، عبور بین سیستمی گفته می شود. این فرآیند مشابه تبدیل درونی است، با این تفاوت که انتقال الکترون بین ترازهایی که چندگانگی متفاوت دارند انجام می شود. بعد از عبور بین سیستمی، مولکول با آسایش ارتعاشی به پایین ترین حالت ارتعاشی در تراز الکترونی که در آن قرار دارد می رود.
مرحله ی فسفرسانس:  به طور معمول تراز های سه تایی که از الکترون پر شده اند به وسیله تبدیل بیرونی و یا عبور بین سیستمی به تراز الکترونی پایه غیرفعال می شوند .(T1→S0) تراز های سه تایی می توانند به وسیله نشر یک فوتون نیز غیرفعال شود. غیر فعال سازی تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی متفاوت، فسفرسانس خوانده می شود. معمولا مدت زمان انجام فسفرسانس 4-10ثانیه می باشد. بیشتر بودن طول عمر فسفرسانس به دلیل غیرمجاز بودن آن به لحاظ اسپینی است (تغییر چندگانگی اسپین در خلال انتقالات از دیدگاه کوانتمی غیر مجاز است). بنابراین تنها زمانی که احتمال وقوع تبدیل بیرونی با سرد کردن نمونه کاهش یابد فسفرسانس رخ می دهد. طول موج فسفرسانس یک ترکیب مشخص معمولا بلندتر از طول موج فلوئورسانس است، به این دلیل که انرژی T1  از انرژی S1 کمتر است (123).
شکل28: دیاگرام جابلونسکی. حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها.
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD)
روش طیف سنجی CD به طور گسترده ای در ارزیابی ساختار و پایداری پروتئین ها در شرایط مختلف محیطی از نظر دما، قدرت یونی، وجود املاح و مولکول های کوچک مورد استفاده قرار می گیرد. در حال حاضر انجام این تکنیک بدلیل اینکه نسبتا آسان است و نیاز به مقدار کمی از نمونه دارد و هم چنین تجزیه و تحلیل داده ها سریع می باشد، تقریبا در همه آزمایشگاه های درگیر با تجزیه و تحلیل پروتئین ها به طور عمده فراهم است. این تکنیک عمدتا برای مطالعه ساختار دوم پروتئین ها استفاده می شود، هر چند از آن می توان برای مطالعه ساختار پپتیدها و نوکلئیک اسیدها نیز استفاده نمود. مطالعه پروتئین ها با این تکنیک حتی با یک غلظت پایین نمونه (10 – 1 میلی گرم / میلی لیتر) در یک گسترده وسیعی از متغیرهای محیطی (دما، pH، و غیره) قابل انجام است. هم چنین این روش می تواند اطلاعاتی را در مورد اثر لیگاندهای اضافه شده به پروتئین نشان دهد. در مورد پروتئین ها نتایج معمولا به صورت مولار الیپتیسیتی Ellipticity)) بیان می شوند و با نماد  [θ]نشان داده می شود که از فرمول زیر قابل محاسبه می باشد:
در این فرمول الیپتیسیتی با θ ، مسیر نور عبوری بر حسب سانتی متر باl ، جرم مولکولی با M، غلظت پروتئین بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر با C، و تعداد رزیجوهای آمینواسید با n نشان داده شده است. درنهایت [θ]بر حسب deg.cm 2 .dmol -1 بدست می آید (124).
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون
2-9-6-1- دناتوراسیون
دناتوراسیون پروتئینی (شکل 29) می تواند یک فرآیند برگشت پذیر و یا غیر قابل برگشت باشد. دناتوراسیون در واقع به تغییری که در کنفورماسیون پروتئین ایجاد شود و منجر به آنفولد شدن کل ساختار پروتئین شود اطلاق می شود. علاوه براین، چنین تغییراتی بدون شکستن پیوندهای پپتیدی رخ می دهد. در این شرایط پروتئین بدلیل از دست دادن ساختار سوم خود فعالیت بیولوژیکی ندارد. از طرفی دناتوراسیون منجر به در معرض قرار گرفتن گروه های هیدروفوبیکی می شود که این امر تمایل جذب سطحی نقاط هیدروفوبیکی پروتئین ها را به یکدیگر و تشکیل و تجمع رسوب پروتئینی را افزایش می دهد (125).
شکل 29: دناتوراسیون پروتئینی.
2-9-6-2- مطالعه ی پایداری پروتئین ها
در تحقیقات بیومولکولی نظیر مهندسی پروتئین، شیمی پروتئین، کشف و طراحی داروها، تعیین فاکتورهای موثر در پایداری پروتئین ها اهمیت بالقوه ای دارد. در این تحقیقات از روی پارامترهایی نظیر تغییرات انرژی آزاد گیبس (°( ΔG و نیز ویژگی هایی که یک پروتئین در حین عبور از حالت طبیعی و فولد شده به حالت غیرطبیعی و آنفولد شده در حین دناتوراسیون پیدا می کند می توان پایداری ترمودینامیکی را مشخص کرد.
در بین پارامترهایی که پایداری یک پروتئین را تعیین می کنند، می توان به موارد زیر اشاره نمود از جمله به پیوندهای هیدروژنی، تعاملات هیدروفوبیک، پیوندهای واندروالسی، پل های نمکی و تعاملات آروماتیکی که همگی بستگی به نوع ترکیب آمینواسیدهای یک پروتئین دارند و نیز تغییرات پس از ترجمه نظیر گلیکوزیله شدن و متیله شدن که روی پروتئین ایجاد می شوند، همچنین یکسری فاکتورهای محیطی نظیر دما، فشار، نمک ها، PH وغیره هستند که روی پایداری یک پروتئین تاثیر می گذارند. به عنوان مثال اضافه نمودن یک ماده ی شیمیایی نظیر گوانیدین هیدروکلراید و یا اوره منجر به دناتوره شدن پروتئین و متعاقب آن تغییر در پایداری پروتئین می شود (127-126).
2-9-6-3- روش دناتوراسیون شیمیایی
اوره و گوانیدین هیدروکلراید ترکیباتی هستند که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند ( شکل30). این ترکیبات با تخریب پیوند های هیدروژنی منجر به آنفولد شدن پروتئین ها می شوند. در غلظت های بالا از این دناتوره کننده ها به عنوان مثال غلظت 8 مولار برای اوره وغلظت 4 مولار برای گوانیدین هیدروکلراید، پروتئین ها تمایل به آنفولد شدن دارند. در حقیقت دناتوراسیون شیمیایی منجر به از دست رفتن پایداری در پروتئین می شود. در حین دناتوراسیون شیمیایی ساختار اولیه پروتئین دست نخورده باقی می ماند. اما ساختارهای دوم وسوم پروتئین دستخوش تغییر می شوند. در این حالت پروتئین از حالت فولد شده به یکی از دوحالت نسبتا فولد شده و کاملا آنفولد شده می رسد. همچنین وجود مرحله ی حد واسط هم در این واکنش از طریق مطالعات دناتوراسیون شیمیایی قابل بررسی می باشد. فرآیند آنفولدینگ بعضی پروتئین ها در حضور گوانیدین هیدروکلراید سه حالت گذار را نشان می دهد، شامل مرحله ی (N) NATIVE، حد واسط (I) و مرحله ی آنفولد شده (U). وجود مرحله ی حدواسط در حین دناتوراسیون نشان دهنده ی پروتئین در حالت کره ی مذاب می باشد که دارای

مطلب مشابه :  پایان نامه رایگان با موضوع عملکرد جنسی