به دست آورد. همچنین مشخص شدن عوامل موثر در تغییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان سرطان ها و برخی بیماری ها موثر باشد.
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش
در این تحقیق تجربی که در سال 3-1392 در دانشگاه علوم پزشکی قزوین صورت گرفت، پلاسمید pLEICS-01 که حاوی ژن ناحیه‏ تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b بود توسط محقق آقای دکتر داریوش ایلغاری، با استفاده از cDNA ژن FGFR2b سالم تهیه شد و به این طرح هدیه شد. ایمیدازول، IPTG و Ni2+-NTA از شرکت سیگما، آمپی‏سیلین و HEPES از شرکت مرک و باکتری ایشریشیا کلی BL21(DE3) از شرکت Invitrogen تهیه شدند. کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب، نیترات نیکل و گوانیدین هیدروکلراید (GdnHCl) از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شدند. بقیه مواد شیمیایی مورد استفاده از نوع خالص بودند و از شرکت سیگما و شرکت مرک تهیه گردیدند.
3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش
1. محیط کشت LB Broth، جهت کشت باکتر ی در حجم بالا
2. محیط کشت LB Agar، جهت تهیه کلونی از باکتری کشت داده شده
3. سلول‏های مستعد (پذیرا) BL21(DE3) ، جهت ترانسفورماسیون
4. پلاسمید pLEICS-01، حاوی ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
5. پروتئین فسفولیپاز C جهت بررسی عملکرد ناحیه کینازی پروتئین
6. آنتی بیوتیک آمپی سیلین جهت انتخاب کلونی های حاوی پلاسمید
7. اسیدکلریدریک 1 مولار جهت تنظیم PH بافرها
8. هیدروکسید سدیم 1 مولار جهت تنظیم PH بافرها
9. ایزوپروپیل بتا-دی-1 تیوگالاکتو پیرانوزید IPTG جهت القاء بیان ژن
10. NaCl جهت تهیه بافر دیالیز، بافر لیزکننده سلولی و بافرهای تخلیص پروتئین
11. Tris base و Tris-Hcl جهت تهیه بافرهای پلی آکریلامی ژل الکتروفرزیس
12. الکل 20% جهت نگهداری ستون نیکل و غشای دیالیز
13. الکل 70% جهت استریل کردن
14. گلایسین جهت تهیه بافر ژل الکتروفرزیس
15. آکریل آمید و بیس آکریل آمید جهت تهیه ی پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس
16. TEMEDو آمونیوم پرسولفات (APS) جهت تهیه پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس
17. گلیسرول جهت تهیه سمپل بافر، استوک باکتری کشت داده شده و بافر لیز کننده سلولی
18. بروموفنول بلو و مرکاپتواتانول جهت تهیه سمپل بافر
19. متانول، کماسی بلو و اسید استیک جهت تهیه بافر Staining
20. ایمیدازول و Hepes جهت تهیه بافر تخلیص پروتئین
21. محلول نیکل جهت تخلیص پروتئین
22. گوانیدین هیدروکلراید (GdnHCl) جهت مطالعات دناتوراسیون شیمیایی
23. مارکر پروتئین جهت بررسی وزن مولکولی پروتئین
24. کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب، نیترات نیکل جهت برهم کنش با پروتئین مورد نظر
3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش
1. اسپکتروفوتومتری مرئی (Visible spectrophotometry)
2. اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)
3. اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy))
4. اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
5. انکوباتور معمولی 37 درجه سانتیگراد (Incubator)
6. انکوباتور شیکردار 37 درجه سانتیگراد (Incubator shaker)
7. انکوباتور شیکر یخچال دار (Refrigerated shaker)
8. سانتریفیوژ معمولی (Centrifuge)
9. فریزر تا 80- درجه سانتیگراد ((Ultra-low temperature lab freezers
10. فریزر تا 20- درجه سانتیگراد ((Ultra-low temperature lab freezers
11. یخچال معمولی 4 درجه سانتیگراد (Refrigerator)
12. دستگاه اتوکلاو (Autoclave)
13. ورتکس (Vortex)
14. دستگاه PH سنج (PH meter)
15. ترازوی دیجیتالی با دقت 0001/0 گرم (1mg Digital scale)
16. ترازوی دیجیتالی با دقت 1گرم (1g Digital scale)
17. دستگاه پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس (Electrophoresis equipment)
18. دستگاه سونیکاتور (Sonication bacterial lysis)
19. دستگاه نانو درآپ (Nanodrop)
20. ستون تخلیص کروماتوگرافی (Column chromatography)
21. غشای دیالیز (Dialysis membrane)
22. بن ماری 37 تا 42 درجه سانتیگراد ( 37 degree water bath)
23. سمپلرهای 10، 100 و 1000 میکرولیتر Sampler))
24. میکروتیوپ 5/1 میلی لیتر Microtube))
25. لوله فالکن 15 و 50 میلی لیتر (Falcon)
26. دستگاه یخ ساز (Ice maker)
3-2- محلول ها و بافرها
3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین
100 میلی گرم آمپی سیلین را در 1 میلی لیتر آب مقطر استریل حل کرده تا غلظت نهایی آن به mg/ml 100 برسد. پس از تهیه، آن را به حجم های کوچکتر تقسیم کرده و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری کردیم.
3-2-2- تهیه ی استوک IPTG
0595/0 میلی گرم IPTG را در 1 میلی لیتر آب مقطر استریل حل کرده تا غلظت نهایی آن به mM 250 برسد. پس از تهیه آن را به حجم های کوچکتر تقسیم کرده و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری کردیم.
3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین
96/1 گرم Tris-Hcl و92/2 گرم NaCl را وزن کرده و در 500 میلی لیتر آب مقطر حل کردیم تا غلظت نهایی هرکدام در محلول به ترتیبب 25 و 100 میلی مولار باشد (PH 8 ).
3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین
این محلول حاوی 10% گلیسرول، 97/2 گرم HEPES و92/2 گرم NaCl می باشد که در 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه گردید. غلظت نهایی HEPES و NaCl در این محلول به ترتیب 25 و 100 میلی مولار بود(PH 8 ).
3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%
1/6 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه، 3/1 میلی لیتر از محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 30% ، 5/2 میلی لیتر از ژل بافر Tris-Hcl 5/0 مولار و 1/0 میلی لیتر از محلول SDS 10% را ترکیب نموده و با اضافه نمودن 50 میکرولیتر APS10% و10 میکرولیتر TEMEDبه محلول آن را به عنوان ژل Stacking استفاده کردیم.
3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%
4/3 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه، 4 میلی لیتر از محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 30% ، 5/2 میلی لیتر از ژل بافر Tris-Hcl 5/1 مولار و1 /0 میلی لیتر از محلول SDS 10% را ترکیب نموده و با اضافه نمودن 50 میکرولیتر APS10% و5 میکرولیتر TEMEDبه محلول آن را به عنوان ژل Resolving استفاده کردیم.
3-2-7- تهیه ی محلول APS10%
برای تهیه ی این محلول 100 میلی گرم آمونیوم پرسولفات را در 1 میلی لیتر آب دیونیزه حل کردیم.
3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer)
3/30 گرم Tris base، 144 گرم گلایسین، 10 گرم SDS را در 1000 میکرولیتر آب دیونیزه حل کرده و در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم (PH 8.3 ).
3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer))
این محلول حاوی 55/3 میلی لیتر آب دیونیزه، 25/1 میلی لیتر Tris-Hcl 5/0 مولار، 5/2 میلی لیتر گلیسرول، 2 میلی لیتر SDS 10%، 2/0 میلی لیتر بروموفنول بلو 5/0 % و 50 میکرولیتر بتا-مرکاپتواتانول است که حجم نهایی محلول به 10 میلی لیتر رسانده شد و در دمای اتاق نگهداری گردید.
3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار
6 گرم Tris base به 60 میلی لیتر آب دیونیزه اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسبی از HCl به محلول PH روی 8 /6 تنظیم گردید و حجم نهایی به 100 میلی لیتر رسانده شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار
23/27 گرم Tris base به 80 میلی لیتر آب دیونیزه اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسبی از HCl به محلول PH روی 8 /8 تنظیم گردید و حجم نهایی به 150 میلی لیتر رسانده شد و در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-12- تهیه ی Staining Buffer
برای تهیه ی 100 میلی لیتر از این بافر به میزان 50 میلی لیتر متانول با 05/0 گرم کماسی بلو،10 میلی لیتر استیک اسید و 40 میلی لیتر آب مقطر استفاده گردید.
3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer
برای تهیه ی 100 میلی لیتر از این بافر به میزان 5 میلی لیتر متانول با 7 میلی لیتر استیک اسید و 88 میلی لیتر آب مقطر استفاده گردید.
3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید
6/87 گرم آکریل امید با 4/2 گرم بیس آکریل آمید را در 300 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و پس از فیلتر کردن در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-15- تهیه بافر SDS
برای تهیه ی 10 میلی لیتر از این بافر، 10 گرم SDS را در 5 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و سپس به حجم 10 میلی لیتر رساندیم. این محلول در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer)
95/5 گرم HEPES، 84/5 گرم NaCl و 36/1 گرم Imidazole را در 1 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 ، 100 و 10 میلی مولار باشد سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم(PH7.5 ).
3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer
95/5 گرم HEPES، 84/5 گرم NaCl و 68 گرم Imidazole را در 1 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 ، 100 و 1000 میلی مولار باشد، سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم(PH7.5 ).
3-2-18- تهیه بافر دیالیز
68/15 گرم Tris-Hcl و 36/23 گرم NaCl را در 4 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 و 100 میلی مولار باشد، سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری نمودیم (PH 7.5 ).
3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl)
25/48 گرم گوانیدین هیدروکلراید را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کردیم تا غلظت نهایی به 8 مولار برسد.
3-2-20- تهیه استوک فلزات
کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب و نیترات نیکل را در آب مقطر یا بافر دیالیز حل کرده، استوک 1 و 2 مولاری تهیه کردیم. در یخچال در 4- درجه سانتیگراد، نگهداری شدند.
3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری
محیط کشت LB Broth
محیط کشت LB Broth را در حجم یک لیتر با اضافه کردن 20 گرم پودر LB تهیه کردیم، سپس اتوکلاو کرده و پس از خنک شدن با اضافه کردن مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک مورد استفاده قرار دادیم.
محیط کشت LB Agar
محیط کشت LB Agar را در حجم 250 میلی لیتر با اضافه کردن 5 گرم LB و 75/3 گرم آگار تهیه کردیم، سپس اتوکلاو نموده و پس از خنک شدن با اضافه نمودن مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک، محیط را داخل پلیت ریخته و از آن جهت محیط کشت جامد باکتری استفاده کردیم.
3-3- روش انجام کار
3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید .pLEICS-01 تصویر A نشان دهنده توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b و تصویر B نشان دهنده نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01است. این پلاسمید به پروتئین در ناحیه N-terminal دنباله هیستیدینی اضافه می کند ((His6-tag. وکتور دارای ناحیه برش آنزیمیTEV پروتئاز جهت برداشتن دنباله هیستیدینی از پروتئین است. هم چنین وکتور شامل آغاز کننده T7 و خاتمه دهنده T7 است.
3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب
3-3-2-1- تهیه ی سلول های پذیرا competent cells))
بدین منظور ابتدا محلول های زیر را آماده کردیم.
10 میلی لیتر محیط کشت استریل LBبدون آنتی بیوتیک تهیه کردیم. همچنین محیط کشت SOB حاوی 2 گرم تریپتون، 5/0 گرم عصاره مخمر، 05/0 گرم NaCl را در 95 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و نیز 1 میلی لیتر KCl میلی مولار اضافه نمودیم و PH محلول را برابر با 7 تنظیم کردیم و حجم نهایی را

مطلب مشابه :  پایان نامه رایگان درباره تجارت الکترونیک، ارزیابی اطلاعات، قابلیت اعتماد، کسب و کار