گرفته شد. آزمایشات اولیه در جهت تعیین حداقل و حداکثر غلظتی از فلزات سمی که روی طیف نشری فلوئورسانس اثر میگذاشت صورت گرفت. طیف نشری حاصل از پروتئین در حضور و عدم حضور فلزات سمی با هم مقایسه شد. هر آزمایش دو بار برای هر طیف نشری تکرار شد.
شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry).
3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD))
مطالعه دورنگ نمایی حلقوی در ناحیه فرابنفش دور (Far-UV-CD) در محدوده طول موج 190 تا 260 نانومتر، با اسپکتروپلاریمتر انجام شد. برای بدست آوردن مقادیر ساختار دوم منظم پروتئین، این طیف سنجی در غلظت 15 میکرومولار پروتئین در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 انجام گرفت. ابتدا دستگاه توسط بافر بلانک شد. سپس به میزان 50 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل کووت 300 میکرولیتری ریخته و با بافر به حجم 300 رساندیم. طیف های بدست آمده با دو بار تکرار و تصحیح در برابر بافر به عنوان شاهد، با نرم افزار مخصوص کاهش نویز از طریق تبدیل فوریه کاملا صاف شدند. آزمایش ها در حضور حداکثر غلظت موثر مشاهده شده در طیف نشری فلوئورسانس یعنی 5/0 مولار برای کلراید آلومینیوم، 10 میلی مولار برای نیترات نیکل، 6 میلی مولار برای کلراید کادمیوم و 300 میکرومولار برای نیترات سرب، صورت گرفت. داده های مربوط به کمک نرم افزار آنالیز طیف های بیضی وارCD spectra deconvolution)) برای محاسبه ی درصد ساختارها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy)).
3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR
این روش صرفا برای بررسی اثر سرب بر پروتئین مورد نظر صورت گرفت. برای بدست آوردن مقادیر ساختار دوم منظم پروتئین این طیف سنجی در غلظت 70 میکرومولار پروتئین در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 انجام گرفت. ابتدا دستگاه توسط بافر بلانک شد. سپس به میزان 152 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل میکروتیوپ ریخته و با بافر، جهت نمودار نیتیو به حجم 200 لاندا رساندیم. برای بررسی اثر سرب، از پروتئین با غلظت ثابت 70 میکرومولار و غلظت های 300 و 500 میکرومولار سرب استفاده شد، سپس حجم نهایی را با بافر به 200 میکرومولار رساندیم. از این نمونه تهیه شده چند قطره مشخص بر روی قرص KBr ریخته و قرص را درون دستگاه قرار دادیم و طول موج ها در محدوده 400 – 4000 cm-1، محاسبه کردیم.
شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس
به منظور ارزیابی پایداری کنفورماسیونی پروتئین تخلیص شده، غلظت های متفاوت از گوانیدین هیدروکلراید از 0 تا 6 مولار تهیه شد. طول موج تحریکی روی 280 نانومتر تنظیم شد. آشکارساز (PMT)روی ولتاژ بالا تنظیم شد. در حضور حداکثر غلظت موثر مشاهده شده در طیف نشری فلوئورسانس، دناتوراسیون شیمیایی انجام گرفت. چندین محلول حاوی پروتئین با غلظت ثابت به میزان 3 میلی گرم بر میلی لیتر در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 تهیه شد. غلظت نهایی گوانیدین هیدروکلراید در هر محلول به میزان 0, 25/0, 5/0, 1, 5/1, 2, 5/2, 3, 5/3, 4, 5/4, 5, 5/ 5و 6 مولار بود. طیف نشری پس از حدود 60 دقیقه زمان انکوباسیون در حضور غلظتهای متفاوت از هر کدام از فلزات سمی به طور جداگانه مونیتور شد. در نهایت طول موج ماکزیمم هر نشر برای رسم نمودار در غلظت های متفاوت دناتوره کننده استفاده گردید. هر آزمایش دو بار تکرار شد.
فصل چهارم
یافته ها و نتایج
4-1- بررسی بیان پروتئین
برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب، باکتری‏های تراریخته در محیط مناسب کشت داده شدند و نمونه‏ها قبل و بعد از القا توسط IPTG مورد ارزیابی قرارگرفتند. نتایج SDS-PAGE نشان داد که بعد از القا توسط IPTG، پروتئین نوترکیب مورد نظر با اندازه تقریبی 38 کیلودالتون بیان شده است. نتایج نشان داد که بهترین میزان بیان 3 الی 4 ساعت بعد ار القا توسط IPTG می‏باشد (شکل41).
شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه لیز شده باکتری دارای حامل نوترکیب قبل از القاء با IPTG و ستون‏های 3 الی 6 بعد از القاء با IPTG یک میلی‏مولار به ترتیب در فاصله زمانی یک، دو، سه و چهار ساعت بعد از القاء می‏باشد.
4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد
نتایج SDS-PAGE نشان داد که در دمای20 درجه سانتی گراد، بعد از القا توسط IPTG، پروتئین نوترکیب مورد نظر با اندازه تقریبی 38 کیلودالتون بیان شده است (شکل 41).
شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه لیز شده باکتری دارای حامل نوترکیب قبل از القاء با IPTG با غلظت یک میلی‏مولار و ستون‏ 3 بعد از القاء با IPTG بعد از یک فاصله بیست و چهار ساعت بعد از القاء می‏باشد.
4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد
بعد از بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتیگراد و مقایسه‏ی نمونه‏های حاصل از لیز سلول و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ آن توسط SDS-PAGE مشاهده شد که پروتئین بیان شده نامحلول است. با تکرار آزمایش در چند دمای مختلف کمتر از 37 درجه سانتیگراد و القای تولید پروتئین در شرایط کاهش دمایی، در نهایت در دمای 20 درجه سانتیگراد پروتئین مورد نظر در فاز محلول به دست آمد (شکل 42).
شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 و 3 به ترتیب نمونه لیز شده باکتری و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ در دمای 37 درجه سانتی گراد، ستون 4 و 5 به ترتیب نمونه لیز شده باکتری و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ در دمای 20 درجه سانتی گراد.
4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده
با توجه به وجود دنباله پلی‏هیستیدین در ابتدای پروتئین مورد نظر برای خالص‏سازی پروتئین بیان شده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni2+-NTAاستفاده شد. شستشوی ستون با استفاده از شیب غلظت ایمیدازول از 50 الی 200 میلی‏مولار صورت پذیرفت. میزان خلوص پروتئین مورد نظر توسط SDS-PAGE ارزیابی گردید. چنانکه در الگوی الکتروفورز مشاهده می‏شود، پروتئین مورد نظر با درجه خلوص مناسبی خالص گردید (شکل43).
شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده ازستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni2+-NTA. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه اولیه قبل از خالص‏سازی، ستون 3 نمونه بعد از شستشوی اولیه ستون کروماتوگرافی و ستون 5 نمونه ی بعد از شستشوی ستون کروماتوگرافی با ایمیدازول با شیب غلظت 50 تا 200 میلی مولار.
4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز
جهت خارج نمودن ایمیدازول از محلول حاوی پروتئین، بعد از تخلیص، پروتئین مورد نظر دیالیز شد و جهت اطمینان از وجود پروتئین و کمیت آن بعد از دیالیز، SDS-PAGE انجام شد (شکل44).
شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی و ستون 2 به بعد نشان دهنده نمونه دیالیز شده می باشد.
4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده
از اتصال ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر با ناحیه‏ی SH2 موجود در سوبسترای گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی جهت بررسی عملکرد پروتئین خالص شده استفاده شد (شکل 45). بررسی الگوی حاصل از PAGE مشخص می‏نماید که ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی SH2 است تعامل برقرار نموده است (ستون چهارم شکل 45) و کمپلکس حاصل دارای الگوی الکتروفورزی متفاوت از هر کدام از دو جزء به تنهایی می‏باشد (ستون اول و دوم شکل 45)، در حالیکه الگوی الکتروفورزی مخلوط حاوی پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2 است که توانایی اتصال به ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر را ندارد (ستون پنجم شکل 45) با الگوی الکتروفورزی هر کدام از دو جزء به تنهایی یکسان است (ستون اول و سوم شکل 45) که نشان دهنده عدم اتصال پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2 است می‏باشد (168).
شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده. ستون 1 ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b، ستون 2 پپتید دارای ناحیه‏ی SH2، ستون 3 پپتید دارای ناحیه‏ی SH2 جهش یافته، ستون 4 کمپلکس پروتئین مورد نظر با پپتید دارای ناحیه‏ی SH2 و ستون 5 مخلوط حاوی پروتئین مورد نظر با پپتید دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2.
4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
با استفاده از روش فلوئورسانس ذاتی وضعیت ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در حضور سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در دمای اتاق بررسی شد. نتایج، کاهش شدت نشر فلوئورسانس را در حضور هر چهار فلز سمی و با افزایش تدریجی غلظت آنها نشان داد. با تیتراسیون هر چهار فلز تغییرات کمی در شیفت حداکثر طول موج نشری فلوئورسانس به سمت طول موج های کوتاهتر مشاهده گردید (شکل46).
الف)
ب)
ج)
د)
شکل 46: نمودارهای مربوط به بررسی ساختارسوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. به روش فلوئورسانس ذاتی. طیف فلوئورسانس از نمونه پروتئینی موجود در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 در دمای اتاق بدست آمد. شکل الف، ب، ج و د به ترتیب نشان دهنده ی طیف فلوئورسانس مربوط به ناحیه ی کینازی در حضور غلظت های متفاوت سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل میباشد. طیف نشری کاهش تدریجی را در شدت فلوئورسانس با افزایش غلظت فلزات نشان می دهد.
4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
اثر افزایش تدریجی غلطت گوانیدین هیدروکلراید روی طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در حضور حداکثر غلظت فلزات ذکر شده در شکل 47 نشان داده شده است. نتایج نشان دادکه فرآیند آنفولدینگ ناحیه ی کینازی در حالت طبیعی یک فرآیند سه مرحله ای است. همچنین هر ساب دومین به طور جداگانه آنفولد می شود. ساختار سوم ناحیه ی کینازی در حضور سرب تغییر می کند. هر چند این تغییرات در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد (شکل47).
الف)
ب)

مطلب مشابه :  دانلود تحقیق در مورد بلندی، پاکوتاهی، میشدند.، دگرگردهافشانی