ن دیدگاه را رد میکند و میگوید: الگویی که فقط بر پایه شغل فرد باشد نمیتواند کاملا واقعیت تفاوتهای اجتماعی را توجیه کند.(محسنی،1363: 263).
به عقیده او موقعیت آدمی در جریان تولید، منشا تجارب مهم زندگی اوست. اما به طور خاص تجربه تعارض اقتصادی است که اهمیت دارد زیرا اعضای طبقه اجتماعی را وا میدارد تا به عقاید مشترک و کنشهای مشترک دست یابند. بنابراین قصد مارکس این است که ویژگیهای مجموعه اقتصادی و اجتماعی را تحت نظام تولید معینی کشف کند. ساختار طبقاتی که تجلی برجسته این مجموعه است زندگی اجتماعی را به صورت منظومههایی سامان میبخشد که از نظام تولیدی نشأت گرفتهاند. طبقه اجتماعی برای مارکس ابزاری برای تحلیل دو جنبه از زندگی اجتماعی است :
عامل پویش تاریخی.
به عنوان عامل تعیین کننده هویت اجتماعی افراد و رو بنای فرهنگی جامعه. در جامعه شناسی معاصر، اهمیت مفهوم طبقه اجتماعی ناشی از جنبه دوم یعنی بعد اجتماعی طبقه است نه نقش تاریخی آن. پیامدهای اجتماعی طبقه چنان نقش عظیمی ایجاد میکند که برای جامعه شناسان قابل چشم پوشی نیست.(اباذری،1381: 9،8).
به عقیده ژرژ گورویچ و هانری مندراس، طبقه نزد مارکس مفهومی مبتنی بر وحدت است. وی تمام خصایص مربوط به نابرابری را در این مفهوم گرد میآورد. به عقیده او افکار و اندیشه ها نیز نمودی طبقاتیاند و اندیشههای مسلط در یک جامعه اندیشه های مسلط آن جامعهاند. همچنین نمودهای قدرت دقیقا به طبقات اجتماعی وابستهاند. (گورویچ و مندراس، 1354: 274).
در اینجا باید از دو جامعه شناس مرتون و بوردیو نام برد که دیدگاهی مارکسیستی داشتند. مرتون از جمله کسانی بود که در قسمت عملکرد طبقات اجتماعی از مارکس تاثیر پذیرفته است با وجود این درباره نحوۀ تفکر هیچ یک از نظریه پردازان کلاسیک به طور منظم نوشتهای ارائه نداده است. پس میتوان آراء مرتون را، البته در بخش طبقات اجتماعی، مارکسیستی دانست. او در زمینه جامعه شناسی علم، بر روابط بینابینی نهاد اجتماعی علم و سایر حوزههای جامعه متمرکز بود؛ بخش اعظم کار او در ارتباط با برنامه جامعه شناسی علم بود که مورد حمایت بنیاد ملی علم قرار گرفت. این برنامه شامل بررسیهای تجربی درباره نظامهای ارزشیابی در چند رشته علمی بود. همچنین کوشید با جریانهای اصلی گسترش یابنده درتوسعه جامعهشناسی به توافق برسد هم از طریق گزارشهای جامعهشناسانه خود از نظریههای اجتماعی و هم از طریق تاکید نظری براهمیت بازشناخت دو سودایی جامعهشناسانه، که بوسیله ساختارهای اجتماعی تولید میشوند. این موضوع از چنان اهمیتی برخودار بود که وی را برآن داشت تا در این زمینه کتابی با عنوان نظریه اجتماعی و ساختار اجتماعی بنویسد تا آنجا که مورد استقبال همگان قرار گرفت و چاپ مجدد آن را در پی داشت.(گروثرز،1378: 39،45).
نظریات بوردیو نیز دربارۀ مفهوم طبقه عمدتاً ترکیبی از دیدگاه کارل مارکس و ماکس وبر است. او تحت تأثیر مارکس رابطه موقعیت طبقاتی و ابزار تولید را در نظر گرفته است و از وبر تحلیل گروههای منزلتی یعنی شیوۀ زندگی، سلیقه و پایگاه را الهام میگیرد.(ممتاز،1383: 150).
در دورهای دیدگاه مارکسیتی درباره طبقه اجتماعی مورد انتقاد جامعه شناسانی چون ژرژ گورویچ و ریمون آرون قرار گرفته است. آنها تعریف و تعیین طبقات اجتماعی را صرفاً با ضابطههای اقتصادی مردود میدانند و در تعیین طبقه عوامل روانی-اجتماعی را هم وارد میکنند.(محسنی،1363: 256).
3. نظام طبقاتی از دیدگاه دین شناسان
الف : سنت گرایان ب: متجددین
از آنجا که بررسی نظام طبقاتی مورد توجه اکثر دانشمندان بوده لذا این موضوع میان دین شناسان مورد بحث است. البته ذکر این نکته لازم است که دین شناسی تنها در دو مفهوم سنتگرایی و تجدد خلاصه نمیشود بلکه دین شناسی شاخههای دیگر را در بر میگیرد که در اینجا محل بحث نیست. اخیراً با گسترش مطالعات دین شناسان در زمینههای مختلف، با نوزایی مفاهیم روبرو میشویم. در همین راستا آنها در بین مطالعات خود با مفاهیمی روبرو میشوند که درصدد تبیین آن بر میآیند. از جمله این مفاهیم سنتگرایی و تجددگرایی است. گفته میشود سنتگرایی و تجددگرایی در واقع دو مسلک فکری هستند از این نظر باهم شباهت دارند اما تفاوت عمده این دو موضع آنها نسبت به عقل است. در واقع عقل است که مسلکها را از هم جدا میکند. در عین حال، در بین سنت گرایان اختلافات کمابیش فراوانی وجود دارد ولی در واقع سنت گرایی با استفاده از عقل از بخش کوچکی از جهان هستی خبر میگیرند و برای شناخت بیشتر به سنت روی میآورند یعنی عقل در کنار سنت. البته این در کنار هم بودن به معنای قرار گرفتن دو موجودی است که یکی بر دیگری برتری دارد در صورتی که تجدد گرایی به معنای این است که برای شناخت جهان هستی تنها نیازمند عقل هستیم. بدین ترتیب سنتگرایی با عقل و تجددگرایی تنها با عقل سروکار دارد .(ملکیان،1386: 379،380،381).
از جمله کسانی که به مطالعه در بخش سنت گرایی پرداخته فریتیوف شوآن و در بخش تجدد باید از الیاده نام برد که در اینجا به بررسی آراء و نظرات آنها میپردازیم.
4. سنتگرایان
فریتیوف شوآن را میتوان یکی از بزرگترین عرضه کننده آموزههای سنتی در دوران معاصر دانست. اندیشههای او در امتداد آرای رنهگنون و آنانداکوماراسوامی است. محوریترین چیزی که در اکثر نوشته های او وجود دارد، دین است. او دل مشغول مطالعه دین و ادیان است و حقیقت دین به معنای دقیق کلمه و نسبت میان دینهای بسیاری که وجود دارند و داشته، در مقیاس جهانی مورد توجه جدی اوست. نصر این نکته را بیان می کند که کاربرد کلمه دین توسط شوآن را میتوان با عطف توجه به کلمه «سنت» فهمید. برای درک بهتر این مفهوم به طور خلاصه به آن می پردازیم. سنت، مفهوم کلیدی دیگری که شوآن در اغلب آثارش دارد و معمولا در پیوند نزدیک با اصطلاح دین از آن استفاده میکند. سنت به عقیده وی و استادانش نه عرف است و نه عادت. سنت صرفاً آن چیزی نیست که در دورهای از تاریخ یک تمدن خاص مورد اعتقاد بوده و به آن عمل میشده است بلکه حقیقتی فوق صوری است. به عبارتی سنت، همه آن چیزهایی است که اصلشان در سپهر الهی است و در وحی به عامترین معنای آن تعیین شده است. بنابراین نه تنها در نسبت با مابعدالطبیعه و دین چنین کاربردی از این اصطلاح وجود دارد بلکه در هنر سنتی، ساختار اجتماعی سنتی و علوم سنتی نیز چنین کاربردی وجود دارد. بنابراین برای فهم عمیق پیام شوآن، رسیدن به شناخت روشنی از معنی اصطلاح سنتی و مصادیق آن ضروری است. آنچه که نصر از بررسی آثار شوآن بدست میآورد نشان میدهد که شوآن اول و قبل هر چیز یک شارح و مفسر مفاهیم سنتی است و میخواهد با این عنوان شناخته شود. لذا هم شرح و ایضای وی از دین، مابعد الطبیعه، هنر و جز اینها نقد و انتقاد او از دنیای مدرن و ناهنجاریها و نقایص آن، بر پایه معنای سنت استوار است. شوآن نه فقط درباره وجود متفاوت امور انسانی و الهی در پرتو سنت مطلب مینویسد بلکه فلسفه، هنر، علم، ساختارهای اجتماعی و سایر اندیشهها و اعمال مربوط با ورود انسان را در پرتو آن حقیقتی که همۀ
سنتها تجلیات آن هستند، مورد نقادی قرار میدهد. او از هر آنچه در مقام شارح، مفسر و منتقد مینویسد، سنتی است.(نصر،1382: 33،34،35).
شوآن در بحث ساختارهای اجتماعی به طور مفصل بحث کرده است. تعریفی که از کاست ارایه میدهد بیان کننده تسلط کامل او حول این محور است. وی میگوید: کاست در معنی معنوی همان قانون یا دهَرمه حاکم بر دسته خاصی از آدمیان بر وفق صلاحیتهای آنان است. در این معنی و فقط در این معنی است که بهگودگیتا گوید: برای هر کس قانون عمل خود او هرچند ناقص باشد بهتراست از قانون دیگری، حتی اگر به طور کامل اجرا گردد. انسان با قانون خود هلاک شود بهتر است از قانون دیگری. تبعیت از قانون دیگری خطرناک است . از نظر او کاست مرکز ثقل نفس فردی است. رده افراطی پاریا(پایین ترین طبقه در هند)، فاقد مرکز است و لذا در محیط دایره به نحو مقلوب زندگی میکند. اگر او به تخطی از قانون میگراید به اعتباری بدان علت است که تخطی از قانون مرکزی را که خود فاقد آن است، به او میبخشد و در نتیجه او را به نحو موهومی از طبیعت نامتعین خویش آزاد میکند. به زعم او نظام اجتماعی هندو، از تفاوتهای روحی یا عقلی بر میخیزد و در عین حال ردههایی پدید میآورد که پیش از پیش از یکدیگر متمایزند. این امر، واقعیتی غیرقابل اجتناب است. همین طور در جایی که براساس سنت کاست وجود ندارد، این نظرگاه، نه فقط از غیاب واقعی تمایز میان افراد ناشی میشود، بلکه همچنین آن عدم تمایز را فعلیت میبخشد یعنی به اعتباری آنچه را که در نظرگاه مقابل باعث پیدایی نظام کاست شده است، از میان میبرد. (شوآن،1388: 17،16، 43).
5. متجددین:
قبل از اینکه به توضیح دیدگاه متجددین نسبت به نظام طبقاتی بپردازیم، لازم است ابتدا اندکی مفهوم متجدد یا بهتر است بگوییم انسان متجدد را بررسی کنیم. میگویند که انسان متجدد دارای ویژگیهایی است که از طریق آن شناخته میشود. موجودی که با مدرن بودن و متجدد بودن توصیف میشود اولاً و بالذات انسان است. آن هم فردی که تقریبا از پانصد سال پیش به این سو ابتدا در اروپای غربی و سپس در آمریکای شمالی بتدریج در سراسر جهان در حال پدید آمدن بوده. پس تجدد وصف فرد انسانی است نه فرد دیگری. البته گفته میشود به اعتبار افراد انسانی، گاهی به جوامع هم چنین صفتی اطلاق میشود، حتی به همین اعتبار تمدنها و حتی دورههای تاریخی را هم متجدد مینامند. بنابران هرگاه جامعه یا تمدنی را متجدد بنامند این نامگذاری به اعتبار افرادی است که جوامع و تمدنها را میسازند و در آن زیست میکنند. حال اینکه انسان که از قرن پانزدهم میلادی شروع به پدید آمدن کرده است چه ویژگیهایی دارد که نسبت به انسانهای دیگر متمایز شده است، جای بحث دارد که در اینجا مجال نیست.(ملکیان:40)
بوجود آمدن انسان متجدد، بررسیها و پژوهشهایی را در پیش داشته است و همواره مورد توجه قرار گرفته است. از بحثها مرتبط با آنها نظام طبقاتی است که متجددین دیدگاههای مختلفی نسبت به آن ارایه کردهاند. از جمله این افراد میرچا الیاده است. او دین شناس بزرگ معاصر و خالق آثار مهم و فراوانی در حوزه دین پژوهی است. نوع دیدگاهها و کثرت آثارش، توجه دین پژوهان را به او معطوف ساخته است. طوری که آثار و نظریات او از جهات مختلف مورد بحث، نقد و چالش قرار گرفته و بخش مهمی از این نقدها متوجه روش شناسی اوست.(زروانی،1382: 29).
با توجه به اینکه وی برای تکمیل مطالعاتش از نزدیک به بررسی جوامع پرداخته است، مطالعاتش میتواند جوابگوی بسیاری از پرسشهای اجتماعی باشد. از جمله بررسیهای او در باب ساختار اجتماعی جوامع هندی یا به تعبیر دیگر کاست است که به خوبی میتوان تأثیرات قبایل نسبت به دیگری، مشاهده کرد. وی در دایره المعارف خود مدخلی را به این موضوع اختصاص داده است. آنچه او بیان میکند نشان دهنده مشاهدات و مطالعات دقیق است که با تیزبینی خاصی آن را انجام داده است. او میگوید:جامعه سنتی هند الگوی چهار گانه طبقاتی را (که در زبان سانسکریت ورنه نام دارد ) میپذیرد که این طبقات به وسیله ملاک درون همسری و برون همسری شناخته میشوند. به اعتقاد وی پایه و اساس قبایل مختلف، که گاهی زیر طبقه نامیده میشود، افسانهای مشترک است. در ادامه او به توضیح گروههای خارج از نظام طبقاتی میپردازد که قبلا آنها را کاست پایین یا نجس مینامیدند. او میگوید: در هند برای این طبقه اصطلاح کاندلا candela،باریجان barijan (اصطلاحی که گاندی وضع کرد ) و نیز پاریا paria به کار میرود. امروزه طبقات پایین

گونگی شکل گیری نظام طبقاتی هندوایرانی است.
بخش پنجم: نتیجهگیری. این بخش بررسیهای صورت گرفته در رابطه با موضوع را مورد تجزیه و تحلیل قرار میدهد.
محور اصلی نوشتههای رساله بر پایه منابع دست اول میباشد. از منابع تحقیقاتی و مقالات نیز استفاده شده است. نویسنده بر آن بوده است تا با طرح عنوان های جدید و تازه اطلاعاتی که در نظر او اهمیت و ارزش بیشتری دارد، از منابع مختلف گردآوری کند و در نوشتن مطالب از آنها بهره بجوید. این رساله با توضیحاتی مقدماتی در باب نظام طبقاتی آغاز شده است. سپس به طور خاص به این مفهوم پرداخته شده است و در آخر بازسازی نظام طبقاتی هندوایرانی بیان شده است. در واقع این نوشتار تلاش میکند که چارچوب نظام طبقاتی هندوایرانی را نشان دهد.
بخش اول: کلیات
کلیات
1. تعریف لغوی و اصطلاحی نظام طبقاتی و کاستی
ارایه تعریف دقیق و روشنی از طبقه اجتماعی به آسانی میسر نیست. زیرا اختلاف نظر در این باب زیاد است. اما توجه محققان و دانشمندان به طبقه و کاست خود باعث بوجود آمدن تعاریف گوناگون شده است. بررسیها نشان میدهد واژه کاست1 در دایره المعارف هندوئیسم2 به کار رفته است، به طوری که همه یک مفهوم را بیان میکنند اما تفاسیر گوناگون است. دکتر کومار و دکتر رام معتقد هستند گسترهای که کاست در آن شکل گرفت یعنی دوره ودهیی، موضوع بحث شدیدی بین دانشمندان شد تا آنجا که باعث به وجود آمدن آراء گوناگونی درباره خاستگاه کاست شد.(کومار و رام،2007: 101).
درباره طبقه نیز تعاریف گوناگونی بیان شده است. در فرهنگ معین طبقه به معنی درجه، مرتبه، صنف و دسته آمده است. (معین،1380: 2211).
مصاحب در دایره المعارف فارسی بیان میکند : طبقه گروه اجتماعیای است که تعلق افرادش به آن موروثی است. در جامعههایی که نظام طبقهای برقرار است افراد هر طبقه از لحاظ انتخاب شغل و شرکت در امور اجتماعی سخت محدودند. وضع اجتماعی فرد با طبقهای که به هنگام ولادت بدان تعلق داشته است مشخص میشود و نیل به طبقه برتر به ندرت امکان پذیر است. با این حال هدف نظام طبقهای برقرار داشتن وضع موجود است.(مصاحب، 1357: 1618).
در برابر طبقه مفهومی به نام کاست قرار دارد. پژوهشگران طبقات اجتماعی را نوعی کاست میخوانند و میگویند مفهوم کاست نوعی طبقه اجتماعی موروثی است که تعیین کننده نقش فرد در بدو تولد است. بر نظام کاستی قوانین خاصی حاکم است. به طوری که هر فرد تنها باید در طبقه خود بماند نه اینکه از طبقه ای به طبقه دیگر برود؛ در طبقه اجتماعی افراد بر اساس امتیاز رتبه بندی میشوند که این امتیازات را فرهنگ و جامعه تعیین میکند.
کاست در لغت به معنای ناب و نگهداری پاکی و خلوص گروه است و در اصطلاح:
به آن سازمان اجتماعی اطلاق میشود که در هند بوجود آمد و مبنای آن را عقاید دینی مبتنی بر برتری برهمنها تشکیل میداد.
گروه خاصی در هند که مبنای ارثی دارند.
طبقه بسته، مبتنی بر وراثت را در بر میگیرد که با دیدی منفی به آن نگریسته می شود. (ساروخانی، 1370: 85).
اما نکتهای که در اکثر ترجمهها به آن برخورد میکنیم اصل واژه کاست است. از آنجا که نظام کاستی مربوط به هند است، کاربرد آن در آنجا نشان میدهد که واژه کاست دراصل هندی نیست بلکه از واژه پرتغالی کاستا 3گرفته شده که به معنای پاکی، نژاد و تعیین کننده اصل و نسب است. واژه هندی کاست جاتی4، در معنی تولد است. از این رو این واژه به تولد نیکو یا اصل و نسب، اعتبار و مقام دلالت دارد.(راشل، 2007: 11). واژه کاست نیز به معنی گروهی از مردم که معمولا با اصل و نسب، ازدواج و شغل شناخته میشوند، ترجمه شده است. همچنین آمده است که این واژه توسط سیاحتگران پرتغالی در قرن 16 وارد هند شد.(دونایگر،2006: 186).
دو اصطلاح جاتی و وَرنَه هر دو به طبقه اجتماعی اشاره دارد اما تفاوت آنها در این است که جاتی ناظر به تبار و خاندان فرد است ولی ورنه به پیشه و کارکرد اجتماعی فرد نظر دارد. هر جاتی به نوبه خود از چندین گوتره5 یعنی طایفه تشکیل میشود.(موحدیان عطار، 1382: 52).اصطلاح هندویی ورنه پیرامون واژه کاست قرار دارد و به معنی رنگ است که با واژه دسا 6مقایسه میشود. همچنین اصطلاحهای راجنیه7، وایشیه8 و شودره7تنها در پورشه سوتکه pursa-sutka دیده شده و اصطلاح برهمنهbrahmana خیلی کمرنگ در ریگ وده آمده است. اصطلاح کشتریهksatriya که شکل کهن راجینه است به ندرت در ریگ وده دیده شده است. همچنین اصطلاح برهمن که به معنی روحانی البته در جایگاه شغل روحانی است تنها در برخی متون وجود دارد.(کومار و رام،2007: 106-103).
شاید بتوان گفت مفهوم طبقه در آیین هندو، به وسیله واژههای ورنه و جاتی بیان میشود. مراد از ورنه یا رنگ، داشتن کیفیتی است که گوهر درونی شخص را نشان میدهد و او را از سایر طبقات به طور کیفی ممتاز میسازد. با توجه به این مفاهیم ابوریحان بیرونی هم اشاره میکند که هندیان طبقات خویش را «برن» یا رنگها مینامند و از حیث نسب آن(یعنی طبقه) را جاتک یا موالید مینامند. براساس این مبانی فکری میراث اجدادی فرد نقش به سزایی در کیفیات اخلاقی و استعداد ذاتی او دارد. پس هر شخص ذاتاً دارای خصوصیاتی است که او را برای انجام دادن وظیفهای مشخص میسازد. این موضوع مبنای فکری کاستها بوده است.(فرهنگ ارشاد، 1365: 73).
با اندکی تامل در نظام کاستی میتوان گفت دلیل بیشترین اختلاف بین هندوها، کاست است. درباره این اختلاف دو دلیل عمده وجود دارد: دلیل اول: اصطلاح کاست هندی نیست بلکه از واژه پرتغالی کاستا9 به معنای نژاد یا قبیله گرفته شده و این با ساختار اجتماعی جامعه هند مطابق نیست. دلیل دوم : کاست برای تمییز دو ساختار اجتماعی، یعنی ورنه و جاتی است. ورنه به تقسیمات جامعه به چهار گروه اشاره دارد، در حالی که جاتی، به هزاران گروه که با شغل و حرفه شناخته میشوند (جکوب،2010: 58). یعنی اگر فردی در طبقه برهمن متولد شود به عنوان یک برهمن باقی میماند و اگر فردی در طبقه شودره متولد شود به عنوان یک شودره باقی میماند و هیچ کس نمیتواند موقعیت اجتماعی خود را تغییر دهد. لذا تولد نقش مهمی در شکل گیری نوع طبقه دارد. نکته مهم درباره کاست هندویی این است که کاست‌های طبقه پایین که نجس یا ناپاک نام دارند حق برخورد یا نزدیک شدن به دیگر طبقات را ندارند. وظایف آنان شامل دفع آلودگی و مرگ از طبقه بالاتر است. البته انسان شناسان بیان میکنند که در روستاهای هند جمعیتی متشکل از این طبقه وجود دارد که تاحدی اجازه دارند به یکی از چهار ورنه نزدیک شوند. بنابراین چندین کاست در روستا بوجود آمد که هر کدام با دیگری در اصطلاحاتی که بکار میبرند و مکان زندگی شان متفاوتند. با این حال آنها گاهی ممکن است برای هدفهای منطقهای با هم یکی شوند و به عنوان یک گروه کاستی در نظر آیند. البته مرز بین جاتیهای گوناگون از طریق قوانین ازدواج مشخص میشود. اینگونه که معمولا بین خانوادهها به توافق میرسید که مرد و زن از یک جاتی یا کاست مشابه باشند، مثلا زن با جاتی بالاتر ازدواج کند. اما تعادل خاص بین کاستها به شرایطی مانند تأثیر متقابل اقتصاد یا سیاست بستگی دارد. بنابراین کاستها و گروههای مختلف آن بوسیله پیوند خویشاوندی مشخص میشوند. بنا به اعتقاد برخی نویسندگان عمدتاً بقای ساختار جامعه هند مربوط به سیاحان خارجی است که در قرن چهار ق.م نوشته شد. درمقایسه با این گروهی دیگر از دو محقق چینی و آسیایی شوان زنگ10و آلبرانی11 یاد میکنند که دیدگاههایی درباره نظام طبقاتی ورنه دارند. آنها به شرح وظایف طبقات پرداختهاند. به این صورت که وظیفه برهمنان حفظ دین است. کشتریهها به اداره و حکمرانی میپردازند، وایشیهها به تجارت و بالاخره شودرهها عهدهدار کشاورزی هستند. شوان زنگ خود در میان طبقات زندگی کرد اما از ترس برخورد با جامعه هند به شرح خطرات نپرداخت. چرا که آنها از چنان مهارتی برخوردار بودند که معرف مشهورترین سنت سانسکریتی است.(کاش،2010: 133).
اشاره به این نکته لازم است که در جوامع هندی تقسیمات کاستی قبل از دوره ودهیی وجود داشته. سپس چهار طبقه بوجود آمده که در ودهها به آن اشاره میشود و عبارتند از: آن طبقه برهمنان (معلمان)12، کشتریه (سربازان)13، وایشیه (بازرگانان)14 و شودره (خدمتکاران)15؛ هر کدام از این طبقات به اجزای کوچکتری تقسیم میشوند. (کلاسترمایر،1998: 38، 39).
در جایی دیگر نیز آمده است: قانون نامه منو چهار طبقه بیان میکند، سپس به برترین طبقه، وایشیه16 و پایینترین آن، شودره اشاره میکند.(دراین، 1998: 23).
به عقیده هینلز واژه کاست یعنی آن پایگاه اجتماعی که موروثی شخص در وقت تولد است. آنها کاست را یک مفهوم دینی نمیدانند، بلکه معتقدند که کاست بستگی تنگاتنگی با دین و جامعه هندو دارد.(هینلز، :1386، 492).
همچنین هستینگ معتقد است نظام کاست، امتیاز اجتماعی است که بین همه ملتها وجود دارد اما به صورت بارز بین هندوها دیده میشود. هر فردی میتواند از طبقه خود همسر انتخاب کند و افرادی که از این کار امتناع کنند به گروههایی تقسیم میشوند که خارج از گروه اجتماعی هستند و اعضا، افراد را وادار میکنند که از ازدواج و خوردن با سایر گروهها بپرهیزند.(هستینگ،1910:320).
از نظر سعیدی مدنی نظام کاست در بین نظامهای قشربندی اجتماعی، منحصر به فرد است. این سخن به این معنا نیست که نظام کاست هند، اصولاً با دیگر انواع قشربندیهای اجتماعی قابل قیاس نباشد، یا هیچ کدام از عناصر کاست در دیگر جاها یافت نشود. بلکه نظامهای کاست در وهله اول، در این ویژگی مشترکند که با تقسیم کار اقتصادی ارتباط آشکاری دارند. او میگوید: این نکته اعم از این که گروههای کاستی واقعی(جاتیها) و یا چهار ورنه سنتی را در نظر بگیریم، آشکارا به چشم می خورد. همچنین به نظریه پردازانی اشاره میکند که از نظر آنها کاست همان قدر به اعمال و شعایر مذهبی مربوط میشود که به اعمال اجتماعی وفردی. زیرا درهم تافتگی و پیچیدگی یک فرد، ریز نگاره یک اجتماع است. (سعیدی مدنی، شماره5: 66-65).
کاست گروه اجتماعی بستهای است که درون همسری در آن معمول میشود و افراد وابسته به کاست مشاغل، اعتقادات و همچنین آداب و مناسک ویژه دارند. هیچ کس نمیتواند از یک کاست به کاست دیگر راه یابد، انسانها در یک کاست متولد میشوند و تا پایان حیات در آن می مانند. او همچنین بیان میکند که دلیل بوجود آمدن نظام کاستی به منظور توزیع مردم و گروهها در برخی از جوامع ماقبل صنعت است و با نظام مبتنی بر طبقات اجتماعی در جامعه صنعتی مشابهت هایی اندک دارد. (عسکری،1381: 67-66).
به عقیده گیدنز نیز نظام کاستی بسیار پیچیده است و از نظر ساخت از یک ناحیه تا ناحیه دیگر فرق می کند، چندان که در واقع به هیچ وجه یک نظام را تشکیل نمیدهد، بلکه مجموعهای از باورها و شیوههای عمل مختلف است که کمابیش با یکدیگر ارتباط دارند اما همه آنها در بعضی اصول کاملا اشتراک دارند. (گیدنز، 1389: 239).
عده ای بر این عقیدهاند که کاست نظام اجتماعی بستهای است که دارای سه ویژگی اساسی است.
1) عضویت 2) ازدواج 3) شغل و حرف.
عضویت: عضویت در هر گروه به کسانی تعلق دارد که در همان گروه یا کاست خود به دنیا آمده باشند، به نوعی عضویت در هر گروه محدود است و شامل تمام انسانها نمیشود.
ازدواج: اعضاء هر گروه، قانوناً مجاز نیستند با افراد گروههای دیگر کاستها ازدواج کنند. در این

گرفته شد. آزمایشات اولیه در جهت تعیین حداقل و حداکثر غلظتی از فلزات سمی که روی طیف نشری فلوئورسانس اثر میگذاشت صورت گرفت. طیف نشری حاصل از پروتئین در حضور و عدم حضور فلزات سمی با هم مقایسه شد. هر آزمایش دو بار برای هر طیف نشری تکرار شد.
شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry).
3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD))
مطالعه دورنگ نمایی حلقوی در ناحیه فرابنفش دور (Far-UV-CD) در محدوده طول موج 190 تا 260 نانومتر، با اسپکتروپلاریمتر انجام شد. برای بدست آوردن مقادیر ساختار دوم منظم پروتئین، این طیف سنجی در غلظت 15 میکرومولار پروتئین در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 انجام گرفت. ابتدا دستگاه توسط بافر بلانک شد. سپس به میزان 50 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل کووت 300 میکرولیتری ریخته و با بافر به حجم 300 رساندیم. طیف های بدست آمده با دو بار تکرار و تصحیح در برابر بافر به عنوان شاهد، با نرم افزار مخصوص کاهش نویز از طریق تبدیل فوریه کاملا صاف شدند. آزمایش ها در حضور حداکثر غلظت موثر مشاهده شده در طیف نشری فلوئورسانس یعنی 5/0 مولار برای کلراید آلومینیوم، 10 میلی مولار برای نیترات نیکل، 6 میلی مولار برای کلراید کادمیوم و 300 میکرومولار برای نیترات سرب، صورت گرفت. داده های مربوط به کمک نرم افزار آنالیز طیف های بیضی وارCD spectra deconvolution)) برای محاسبه ی درصد ساختارها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy)).
3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR
این روش صرفا برای بررسی اثر سرب بر پروتئین مورد نظر صورت گرفت. برای بدست آوردن مقادیر ساختار دوم منظم پروتئین این طیف سنجی در غلظت 70 میکرومولار پروتئین در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 انجام گرفت. ابتدا دستگاه توسط بافر بلانک شد. سپس به میزان 152 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل میکروتیوپ ریخته و با بافر، جهت نمودار نیتیو به حجم 200 لاندا رساندیم. برای بررسی اثر سرب، از پروتئین با غلظت ثابت 70 میکرومولار و غلظت های 300 و 500 میکرومولار سرب استفاده شد، سپس حجم نهایی را با بافر به 200 میکرومولار رساندیم. از این نمونه تهیه شده چند قطره مشخص بر روی قرص KBr ریخته و قرص را درون دستگاه قرار دادیم و طول موج ها در محدوده 400 – 4000 cm-1، محاسبه کردیم.
شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس
به منظور ارزیابی پایداری کنفورماسیونی پروتئین تخلیص شده، غلظت های متفاوت از گوانیدین هیدروکلراید از 0 تا 6 مولار تهیه شد. طول موج تحریکی روی 280 نانومتر تنظیم شد. آشکارساز (PMT)روی ولتاژ بالا تنظیم شد. در حضور حداکثر غلظت موثر مشاهده شده در طیف نشری فلوئورسانس، دناتوراسیون شیمیایی انجام گرفت. چندین محلول حاوی پروتئین با غلظت ثابت به میزان 3 میلی گرم بر میلی لیتر در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 تهیه شد. غلظت نهایی گوانیدین هیدروکلراید در هر محلول به میزان 0, 25/0, 5/0, 1, 5/1, 2, 5/2, 3, 5/3, 4, 5/4, 5, 5/ 5و 6 مولار بود. طیف نشری پس از حدود 60 دقیقه زمان انکوباسیون در حضور غلظتهای متفاوت از هر کدام از فلزات سمی به طور جداگانه مونیتور شد. در نهایت طول موج ماکزیمم هر نشر برای رسم نمودار در غلظت های متفاوت دناتوره کننده استفاده گردید. هر آزمایش دو بار تکرار شد.
فصل چهارم
یافته ها و نتایج
4-1- بررسی بیان پروتئین
برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب، باکتری‏های تراریخته در محیط مناسب کشت داده شدند و نمونه‏ها قبل و بعد از القا توسط IPTG مورد ارزیابی قرارگرفتند. نتایج SDS-PAGE نشان داد که بعد از القا توسط IPTG، پروتئین نوترکیب مورد نظر با اندازه تقریبی 38 کیلودالتون بیان شده است. نتایج نشان داد که بهترین میزان بیان 3 الی 4 ساعت بعد ار القا توسط IPTG می‏باشد (شکل41).
شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه لیز شده باکتری دارای حامل نوترکیب قبل از القاء با IPTG و ستون‏های 3 الی 6 بعد از القاء با IPTG یک میلی‏مولار به ترتیب در فاصله زمانی یک، دو، سه و چهار ساعت بعد از القاء می‏باشد.
4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد
نتایج SDS-PAGE نشان داد که در دمای20 درجه سانتی گراد، بعد از القا توسط IPTG، پروتئین نوترکیب مورد نظر با اندازه تقریبی 38 کیلودالتون بیان شده است (شکل 41).
شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه لیز شده باکتری دارای حامل نوترکیب قبل از القاء با IPTG با غلظت یک میلی‏مولار و ستون‏ 3 بعد از القاء با IPTG بعد از یک فاصله بیست و چهار ساعت بعد از القاء می‏باشد.
4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد
بعد از بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتیگراد و مقایسه‏ی نمونه‏های حاصل از لیز سلول و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ آن توسط SDS-PAGE مشاهده شد که پروتئین بیان شده نامحلول است. با تکرار آزمایش در چند دمای مختلف کمتر از 37 درجه سانتیگراد و القای تولید پروتئین در شرایط کاهش دمایی، در نهایت در دمای 20 درجه سانتیگراد پروتئین مورد نظر در فاز محلول به دست آمد (شکل 42).
شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 و 3 به ترتیب نمونه لیز شده باکتری و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ در دمای 37 درجه سانتی گراد، ستون 4 و 5 به ترتیب نمونه لیز شده باکتری و مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ در دمای 20 درجه سانتی گراد.
4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده
با توجه به وجود دنباله پلی‏هیستیدین در ابتدای پروتئین مورد نظر برای خالص‏سازی پروتئین بیان شده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni2+-NTAاستفاده شد. شستشوی ستون با استفاده از شیب غلظت ایمیدازول از 50 الی 200 میلی‏مولار صورت پذیرفت. میزان خلوص پروتئین مورد نظر توسط SDS-PAGE ارزیابی گردید. چنانکه در الگوی الکتروفورز مشاهده می‏شود، پروتئین مورد نظر با درجه خلوص مناسبی خالص گردید (شکل43).
شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده ازستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni2+-NTA. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی، ستون 2 نمونه اولیه قبل از خالص‏سازی، ستون 3 نمونه بعد از شستشوی اولیه ستون کروماتوگرافی و ستون 5 نمونه ی بعد از شستشوی ستون کروماتوگرافی با ایمیدازول با شیب غلظت 50 تا 200 میلی مولار.
4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز
جهت خارج نمودن ایمیدازول از محلول حاوی پروتئین، بعد از تخلیص، پروتئین مورد نظر دیالیز شد و جهت اطمینان از وجود پروتئین و کمیت آن بعد از دیالیز، SDS-PAGE انجام شد (شکل44).
شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز. ستون 1 نشانگر وزن مولکولی و ستون 2 به بعد نشان دهنده نمونه دیالیز شده می باشد.
4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده
از اتصال ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر با ناحیه‏ی SH2 موجود در سوبسترای گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی جهت بررسی عملکرد پروتئین خالص شده استفاده شد (شکل 45). بررسی الگوی حاصل از PAGE مشخص می‏نماید که ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی SH2 است تعامل برقرار نموده است (ستون چهارم شکل 45) و کمپلکس حاصل دارای الگوی الکتروفورزی متفاوت از هر کدام از دو جزء به تنهایی می‏باشد (ستون اول و دوم شکل 45)، در حالیکه الگوی الکتروفورزی مخلوط حاوی پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2 است که توانایی اتصال به ناحیه کینازی پروتئین مورد نظر را ندارد (ستون پنجم شکل 45) با الگوی الکتروفورزی هر کدام از دو جزء به تنهایی یکسان است (ستون اول و سوم شکل 45) که نشان دهنده عدم اتصال پروتئین مورد نظر با پپتیدی که دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2 است می‏باشد (168).
شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده. ستون 1 ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b، ستون 2 پپتید دارای ناحیه‏ی SH2، ستون 3 پپتید دارای ناحیه‏ی SH2 جهش یافته، ستون 4 کمپلکس پروتئین مورد نظر با پپتید دارای ناحیه‏ی SH2 و ستون 5 مخلوط حاوی پروتئین مورد نظر با پپتید دارای ناحیه‏ی جهش یافته SH2.
4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
با استفاده از روش فلوئورسانس ذاتی وضعیت ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در حضور سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در دمای اتاق بررسی شد. نتایج، کاهش شدت نشر فلوئورسانس را در حضور هر چهار فلز سمی و با افزایش تدریجی غلظت آنها نشان داد. با تیتراسیون هر چهار فلز تغییرات کمی در شیفت حداکثر طول موج نشری فلوئورسانس به سمت طول موج های کوتاهتر مشاهده گردید (شکل46).
الف)
ب)
ج)
د)
شکل 46: نمودارهای مربوط به بررسی ساختارسوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. به روش فلوئورسانس ذاتی. طیف فلوئورسانس از نمونه پروتئینی موجود در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 در دمای اتاق بدست آمد. شکل الف، ب، ج و د به ترتیب نشان دهنده ی طیف فلوئورسانس مربوط به ناحیه ی کینازی در حضور غلظت های متفاوت سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل میباشد. طیف نشری کاهش تدریجی را در شدت فلوئورسانس با افزایش غلظت فلزات نشان می دهد.
4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
اثر افزایش تدریجی غلطت گوانیدین هیدروکلراید روی طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در حضور حداکثر غلظت فلزات ذکر شده در شکل 47 نشان داده شده است. نتایج نشان دادکه فرآیند آنفولدینگ ناحیه ی کینازی در حالت طبیعی یک فرآیند سه مرحله ای است. همچنین هر ساب دومین به طور جداگانه آنفولد می شود. ساختار سوم ناحیه ی کینازی در حضور سرب تغییر می کند. هر چند این تغییرات در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد (شکل47).
الف)
ب)

با آب دیونیزه به 100 رساندیم، در دو فلاسک 250 میلی لیتری تقسیم و اتوکلاو نمودیم. قبل از استفاده، به محلول، 5/0 میلی لیتر MgCl2 استریل با غلظت 2 مولار اضافه کردیم. محلول گلیسرول 50 درصد را پس از آماده کردن جهت استریل سازی اتوکلاو نموده و در دمای 4 درجه نگهداری کردیم. هم چنین غلظت نهایی گلیسرول در محلول به میزان 15 درصد رسانده شد. محلول CaCl2 با غلظت 50 میلی مولار را از طریق یک فیلتر 2/0 میکرومتری استریل نموده و درون یک محفظه استریل نگهداری کردیم.
روش آماده سازی سلول های پذیرا
روی محیط کشت LB Agar بدون آنتی بیوتیک تهیه شده از قبل سلول های ای کلای BL21 DE3 را استریک کرده و سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب انکوبه شد. یک کلونی را از روی پلیت به داخل 10 میلی لیتر محیط کشت استریل وارد کرده و به مدت یک شب در دمای 37 درجه روی انکوباتور شیکردار با 200 دور بر دقیقه انکوبه کردیم. یک میلی لیتر از این محیط را به 50 میلی لیتر از محیط کشت SOB اضافه گردید و در دمای 37 درجه روی انکوباتور شیکردار با 200 دور بر دقیقه انکوبه شد تا زمانی که جذب در 600 نانومتر به 5/0 رسید. سپس سلول ها توسط سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در چهار درجه سانتی گراد با 5000 دور بر دقیقه رسوب داده شد. رسوب سلولی خیلی آرام در 50 میکرو لیتر CaCl2 سرده شده احیا گردید و به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار داده شد. سلول ها مثل قبل رسوب داده شدند و با 2 میلی لیتر CaCl2 در حضور سرما به آرامی احیا شدند و سلول ها روی یخ نگهداشته شدند. گلیسرول 50 درصد به سلو ل ها اضافه شد و به آرامی مخلوط گردید. به میزان 100 میکرولیتر داخل میکروتیوپ تقسیم شد و در دمای 70- درجه سانتی گراد ذخیره گردید.
3-3-2-2- ترانسفورماسیون سلول های پذیرا
محلول های مورد نیاز
محلول های مورد نیاز برای ترانسفورماسیون شامل آماده سازی محیط کشت LB broth بدون آنتی بیوتیک و پلیت های LB agar حاوی مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک می باشد.
روش ترانسفورماسیون
داخل اپندورف تیوپ های 5/1 میلی لیتری استریل به میزان 50 میکرولیتر از سلول های پذیرا ریخته شد پس از اضافه نمودن 4 میکرولیتر پلاسمید تخلیص شده (پلاسمیدها به روش مینی پرپ استخراج شده بودند) به آرامی مخلوط گردید و سپس به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شد. از دمای 42 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه به منظور ایجاد شوک حرارتی استفاده گردید. نمونه ها به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. به میزان 300 میکرولیتر LB broth بدون آنتی بیوتیک به مخلوط اضافه نموده و به مدت 45 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد و داخل انکوباتور شیکردار انکوباسیون را انجام دادیم. سلول هارا داخل پلیت های LB agar حاوی مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک به صورت زیر تقسیم شدند. پلیت A شامل سلول های پذیرای حاوی پلاسمید و آنتی بیوتیک مناسب. پلیت B شامل سلول های پذیرا و آنتی بیوتیک. پلیت Cشامل سلول های پذیرا و آگار فاقد آنتی بیوتیک. سرانجام در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت یک شب انکوباسیون صورت گرفت. اگر کار درست انجام شده باشد باید روی پلیت های A و C کلنی باکتری رشد کرده باشد ولی روی پلیت B کلنی باکتری مشاهده نگردد. کلنی های باکتریایی که روی پلیت A رشد می کنند حاوی کلنی های حاوی پلاسمید مورد نظر هستند (شکل 34).
شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون.
3-3-2-3- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد
از کلنی های ترانسفورم شده، یک کلنی مناسب انتخاب می شود و داخل 3 میلی لیتر از محیط کشت LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود انکوبه گردید و تقریبأ به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و داخل انکوباتور شیکردار با دور rpm 200 رشد داده شد. سپس به منظور ساب کالچر به میزان 5/0 میلی لیتر از کالچرهای رشد داده شده به داخل 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود منتقل گردید و به مدت یک شب در همان شرایط داخل انکوباتور شیکردار قرار گرفت. بعد از این مرحله سلول ها به مدت 10 دقیقه درون سانتریفیوژ با دور rpm5000 گذاشته شدند. سپس رسوب های سلولی حاصل با 1 میلی لیتر از LB تازه بدون آنتی بیوتیک احیا گردیدند و پس از آن به 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود جهت ساب کالچر انتقال داده شدند. این مرحله تا زمانی که جذب در 600 نانومتر به حدود 1/0 برسد ادامه یافت. از باقیمانده ی رسوب سلولی نیز جهت استخراج پلاسمید در فریزر نگهداری شد. درادامه به منظور رشد بیشتر کالچرها در دمای 37 درجه داخل انکوباتور شیکردار قرار داده شدند تا زمانی که جذب در 600 نانومتر برابر 6/0تا 7/0 شد. به این مرحله فاز رشد لگاریتمی میگویند. سپس از هر کالچر به میزان 500 میکرولیتر داخل میکروتیوپ استریل ریخته شد و در دمای 20- درجه سانتی گراد به منظور نمونه قبل از القا جهت آنالیز SDS-PAGE ذخیره شد. هم چنین به میزان 700 میکرولیتر از کالچر قبل از القا با 300 میکرولیتر ازگلیسرول 50 درصد مخلوط گردید واستوک حاصل با 15 درصد گلیسرول در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. سپس القای بیان پروتئین ها با اضافه نمودن IPTG به میزان 1 میلی مولار صورت گرفت. پس از هر ساعت که از زمان القای بیان پروتئین گذشت به منظورجمع آوری نمونه بعد از القا جهت آنالیز SDS-PAGE براساس حجم نمونه ی جمع آوری شده در مرحله قبل از القای بیان پروتئین، نرمالایز صورت گرفت. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در سانتریفوژ با دور rpm 5000 قرارگرفتند و سرانجام رسوب سلولی حاصل جهت آنالیز SDS-PAGE برای بررسی پروتئین تولید شده مورد استفاده قرار گرفتند.
3-3-2-4- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد
جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده پس از القا، در نهایت به مدت 10 دقیقه کالچرها در سانتریفیوژ با دور rpm 5000 قرار داده شد و رسوب سلولی حاصل با اضافه نمودن 10 میلی لیتر بافر لیز سلولی احیا گردید و سپس سلول ها به مدت 2 دقیقه با استفاده از سونیکاتور که روی شرایط 20 ثانیه روشن و 20 ثانیه خاموش و بالاترین ولتاژ تنظیم شده بود سونیکیت گردیده و لیز شدند. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت سلولی حاصل به میزان 100 میکرولیتر به عنوان لایزت کل سلولی جمع آوری شد و همچنین به مدت 20 دقیقه باقیمانده ی لایزت را در سانتریفیوژ با دور rpm12500 قرارداده شد. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت شفاف (soluble fractions) به میزان 20 میکرولیتر جمع آوری و نگهداری شد.
3-3-2-5- روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین
هر نمونه با 40 میکرولیتر آب دیونیزه و60 میکرولیتراز بافرنمونه مخلوط شدند.سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و همچنین به مدت 15 دقیقه با حداکثر دور سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ به میزان 20 میکرولیتر از سوپرناتانت هر نمونه درون چاهک های ژل با گرادیان غلظتی 4 تا 12 درصد از پلی آکریل آمید ریخته شد و هم چنین مارکر وزن مولکولی نیز درون یک چاهک قرار گرفت. جهت الکتروفرز ولتاژی برابر با ولت 200 به مدت 35 دقیقه درون میزان مناسبی از بافر الکترود برقرار شد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با بافر رنگ آمیزی به مدت 35 دقیقه رنگ می شود و درآخر با بافر رنگ بر به مدت 30 دقیقه رنگ زدایی صورت می گیرد.
شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین.
3-3-2-6- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد
در آنالیز SDS-PAGE جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد نمونه ی لایزت کل سلولی با سوپرناتانت لایزت شفاف مقایسه گردید. از آنجا که در این دما پروتئین محلول نبود با تغییر شرایط آزمایش به صورت کاهش دمای رشد باکتری از 37 درجه به 20 درجه سانتیگراد القای تولید پروتئین صورت گرفت. در این روش پس از کشت اولیه و رسیدن به زمانیکه جذب در 600 نانومتر برابر با 6/0تا 7/0 بود کالچرها به مدت 1 ساعت در دمای 20 درجه سانتیگراد درون شیکر انکوباتور یخچال دار قرار داده شدند، هم چنین به منظور آنالیز SDS-PAGE به میزان 100 میکرولیتر نمونه تحت عنوان قبل از القا جمع آوری گردید. سپس به میزان 1 میلی مولار IPTG جهت القا به محیط کشت افزوده شد و به مدت یک شب در دمای 20 درجه سانتیگراد در انکوباتور یخچال دار قرار داده شد. پس از تایید محلول شدن در دمای 20 درجه سانتیگراد، پروتئین به میزان 1 لیتر تولید گردید و در نهایت رسوب سلولی حاصل جهت تخلیص پروتئین جمع آوری گردید.
3-3-2-7- تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی
رسوب سلولی حاصل در 30 میلی لیتر بافر لیز کننده احیا گردید و سونیکیت شد. سپس به مدت 1 ساعت داخل سانتریفیوژ با دور rpm 13500 در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سانتریفیوژ، سوپرناتانت شفاف جمع آوری شد و جهت خالص سازی پروتئین در ستون حاوی 5 میلی لیتر از NTA – 2+ Ni ریخته شد. سپس ستون با یک گرادیان غلظتی افزایشی از ایمیدازول 50، 75، 100، 150 و 200 میلی مولار شسته شد. پروتئین سرانجام در غلظت 75 میلی مولار از ستون خارج گردید. میزان خلوص پروتئین مد نظر توسط آنالیز SDS-PAGE ارزیابی گردید. فرکشن های حاوی پروتئین هدف با هم ترکیب شده و به مدت 6 ساعت در 4 لیتر از بافر دیالیز قرار گرفت. نمونه دیالیز شده با آنالیز SDS-PAGE بررسی گردید.
شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی.
3-3-3- تعیین غلظت پروتئین
با استفاده از دستگاه نانو درآپ غلظت پروتئین اندازه گیری شد. قبل از اندازه گیری، سیستم با استفاده از یک محلول بلانک (2 میکرولیتر از بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7) صفرشد. در این محاسبه وزن مولکولی پروتئین به میزان 38 کیلو دالتون اعمال شد.
3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس
برای بررسی ساختار سوم پروتئین تخلیص شده در شرایط متفاوت از روش فلوئورسانس ذاتی استفاده شد. انداره گیری شدت فلوئورسانس ذاتی با دستگاه اسپکتروفلوریمتر واریان کری اکلیپس مدل Bio 700، حاوی کووت کوارتز با طول مسیر 10 میلی متر صورت گرفت. آشکارساز (PMT)روی ولتاژ متوسط تنظیم شد. هر یک از دو شکاف های تحریکی و انتشاری با یک باند پاس 5 نانومتر استفاده شد. طول موج تحریک پروتئین 280 نانومتر بود و داده ها در دمای اتاق و طول موج نشری 300 تا 450 نانومتر جمع آوری شدند. به منظور از بین بردن اثر پس زمینه ی بافر حاوی پروتئین روی شدت فلوئورسانس، سیستم با استفاده از یک محلول بلانک (400 میکرولیتر از بافر) صفر شد.
پروتئین با غلظت 3 میلی گرم بر میلی لیتر در بافر حاوی 25 میلی مولار Tris-Hcl و 100 میلی مولار NaCl با PH برابر 5/7 تهیه شد. غلظت پروتئین در همه ی محلول های مورد آزمایش ثابت نگه داشته شد. به میزان 15 میکرولیتر از نمونه پروتئینی داخل کووت 400 میکرولیتری ریخته و با بافر به حجم نهایی رساندیم. به منظور بررسی اثر فلزات سمی روی شدت فلوئورسانس پروتئین، چندین محلول حاوی غلظت های ثابت از پروتئین در حضور غلظت های متفاوت از محدوده ی 100 میکرومولار تا 1000میکرومولار از کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب و نیترات نیکل و اثر هرکدام در شرایط نرمال بررسی گردید. هم چنین با اضافه کردن میزان مناسبی از بافر به هر نمونه، حجم نهایی محلول به میزان 400 میکرولیتر نگه داشته شد. سپس طیف نشری بعد از گذشت زمان اینکوبیشن به مدت 30 دقیقه

به دست آورد. همچنین مشخص شدن عوامل موثر در تغییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان سرطان ها و برخی بیماری ها موثر باشد.
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش
در این تحقیق تجربی که در سال 3-1392 در دانشگاه علوم پزشکی قزوین صورت گرفت، پلاسمید pLEICS-01 که حاوی ژن ناحیه‏ تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b بود توسط محقق آقای دکتر داریوش ایلغاری، با استفاده از cDNA ژن FGFR2b سالم تهیه شد و به این طرح هدیه شد. ایمیدازول، IPTG و Ni2+-NTA از شرکت سیگما، آمپی‏سیلین و HEPES از شرکت مرک و باکتری ایشریشیا کلی BL21(DE3) از شرکت Invitrogen تهیه شدند. کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب، نیترات نیکل و گوانیدین هیدروکلراید (GdnHCl) از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شدند. بقیه مواد شیمیایی مورد استفاده از نوع خالص بودند و از شرکت سیگما و شرکت مرک تهیه گردیدند.
3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش
1. محیط کشت LB Broth، جهت کشت باکتر ی در حجم بالا
2. محیط کشت LB Agar، جهت تهیه کلونی از باکتری کشت داده شده
3. سلول‏های مستعد (پذیرا) BL21(DE3) ، جهت ترانسفورماسیون
4. پلاسمید pLEICS-01، حاوی ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
5. پروتئین فسفولیپاز C جهت بررسی عملکرد ناحیه کینازی پروتئین
6. آنتی بیوتیک آمپی سیلین جهت انتخاب کلونی های حاوی پلاسمید
7. اسیدکلریدریک 1 مولار جهت تنظیم PH بافرها
8. هیدروکسید سدیم 1 مولار جهت تنظیم PH بافرها
9. ایزوپروپیل بتا-دی-1 تیوگالاکتو پیرانوزید IPTG جهت القاء بیان ژن
10. NaCl جهت تهیه بافر دیالیز، بافر لیزکننده سلولی و بافرهای تخلیص پروتئین
11. Tris base و Tris-Hcl جهت تهیه بافرهای پلی آکریلامی ژل الکتروفرزیس
12. الکل 20% جهت نگهداری ستون نیکل و غشای دیالیز
13. الکل 70% جهت استریل کردن
14. گلایسین جهت تهیه بافر ژل الکتروفرزیس
15. آکریل آمید و بیس آکریل آمید جهت تهیه ی پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس
16. TEMEDو آمونیوم پرسولفات (APS) جهت تهیه پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس
17. گلیسرول جهت تهیه سمپل بافر، استوک باکتری کشت داده شده و بافر لیز کننده سلولی
18. بروموفنول بلو و مرکاپتواتانول جهت تهیه سمپل بافر
19. متانول، کماسی بلو و اسید استیک جهت تهیه بافر Staining
20. ایمیدازول و Hepes جهت تهیه بافر تخلیص پروتئین
21. محلول نیکل جهت تخلیص پروتئین
22. گوانیدین هیدروکلراید (GdnHCl) جهت مطالعات دناتوراسیون شیمیایی
23. مارکر پروتئین جهت بررسی وزن مولکولی پروتئین
24. کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب، نیترات نیکل جهت برهم کنش با پروتئین مورد نظر
3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش
1. اسپکتروفوتومتری مرئی (Visible spectrophotometry)
2. اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)
3. اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy))
4. اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
5. انکوباتور معمولی 37 درجه سانتیگراد (Incubator)
6. انکوباتور شیکردار 37 درجه سانتیگراد (Incubator shaker)
7. انکوباتور شیکر یخچال دار (Refrigerated shaker)
8. سانتریفیوژ معمولی (Centrifuge)
9. فریزر تا 80- درجه سانتیگراد ((Ultra-low temperature lab freezers
10. فریزر تا 20- درجه سانتیگراد ((Ultra-low temperature lab freezers
11. یخچال معمولی 4 درجه سانتیگراد (Refrigerator)
12. دستگاه اتوکلاو (Autoclave)
13. ورتکس (Vortex)
14. دستگاه PH سنج (PH meter)
15. ترازوی دیجیتالی با دقت 0001/0 گرم (1mg Digital scale)
16. ترازوی دیجیتالی با دقت 1گرم (1g Digital scale)
17. دستگاه پلی آکریل آمید ژل الکتروفرزیس (Electrophoresis equipment)
18. دستگاه سونیکاتور (Sonication bacterial lysis)
19. دستگاه نانو درآپ (Nanodrop)
20. ستون تخلیص کروماتوگرافی (Column chromatography)
21. غشای دیالیز (Dialysis membrane)
22. بن ماری 37 تا 42 درجه سانتیگراد ( 37 degree water bath)
23. سمپلرهای 10، 100 و 1000 میکرولیتر Sampler))
24. میکروتیوپ 5/1 میلی لیتر Microtube))
25. لوله فالکن 15 و 50 میلی لیتر (Falcon)
26. دستگاه یخ ساز (Ice maker)
3-2- محلول ها و بافرها
3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین
100 میلی گرم آمپی سیلین را در 1 میلی لیتر آب مقطر استریل حل کرده تا غلظت نهایی آن به mg/ml 100 برسد. پس از تهیه، آن را به حجم های کوچکتر تقسیم کرده و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری کردیم.
3-2-2- تهیه ی استوک IPTG
0595/0 میلی گرم IPTG را در 1 میلی لیتر آب مقطر استریل حل کرده تا غلظت نهایی آن به mM 250 برسد. پس از تهیه آن را به حجم های کوچکتر تقسیم کرده و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری کردیم.
3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین
96/1 گرم Tris-Hcl و92/2 گرم NaCl را وزن کرده و در 500 میلی لیتر آب مقطر حل کردیم تا غلظت نهایی هرکدام در محلول به ترتیبب 25 و 100 میلی مولار باشد (PH 8 ).
3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین
این محلول حاوی 10% گلیسرول، 97/2 گرم HEPES و92/2 گرم NaCl می باشد که در 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه گردید. غلظت نهایی HEPES و NaCl در این محلول به ترتیب 25 و 100 میلی مولار بود(PH 8 ).
3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%
1/6 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه، 3/1 میلی لیتر از محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 30% ، 5/2 میلی لیتر از ژل بافر Tris-Hcl 5/0 مولار و 1/0 میلی لیتر از محلول SDS 10% را ترکیب نموده و با اضافه نمودن 50 میکرولیتر APS10% و10 میکرولیتر TEMEDبه محلول آن را به عنوان ژل Stacking استفاده کردیم.
3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%
4/3 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه، 4 میلی لیتر از محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 30% ، 5/2 میلی لیتر از ژل بافر Tris-Hcl 5/1 مولار و1 /0 میلی لیتر از محلول SDS 10% را ترکیب نموده و با اضافه نمودن 50 میکرولیتر APS10% و5 میکرولیتر TEMEDبه محلول آن را به عنوان ژل Resolving استفاده کردیم.
3-2-7- تهیه ی محلول APS10%
برای تهیه ی این محلول 100 میلی گرم آمونیوم پرسولفات را در 1 میلی لیتر آب دیونیزه حل کردیم.
3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer)
3/30 گرم Tris base، 144 گرم گلایسین، 10 گرم SDS را در 1000 میکرولیتر آب دیونیزه حل کرده و در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم (PH 8.3 ).
3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer))
این محلول حاوی 55/3 میلی لیتر آب دیونیزه، 25/1 میلی لیتر Tris-Hcl 5/0 مولار، 5/2 میلی لیتر گلیسرول، 2 میلی لیتر SDS 10%، 2/0 میلی لیتر بروموفنول بلو 5/0 % و 50 میکرولیتر بتا-مرکاپتواتانول است که حجم نهایی محلول به 10 میلی لیتر رسانده شد و در دمای اتاق نگهداری گردید.
3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار
6 گرم Tris base به 60 میلی لیتر آب دیونیزه اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسبی از HCl به محلول PH روی 8 /6 تنظیم گردید و حجم نهایی به 100 میلی لیتر رسانده شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار
23/27 گرم Tris base به 80 میلی لیتر آب دیونیزه اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسبی از HCl به محلول PH روی 8 /8 تنظیم گردید و حجم نهایی به 150 میلی لیتر رسانده شد و در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-12- تهیه ی Staining Buffer
برای تهیه ی 100 میلی لیتر از این بافر به میزان 50 میلی لیتر متانول با 05/0 گرم کماسی بلو،10 میلی لیتر استیک اسید و 40 میلی لیتر آب مقطر استفاده گردید.
3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer
برای تهیه ی 100 میلی لیتر از این بافر به میزان 5 میلی لیتر متانول با 7 میلی لیتر استیک اسید و 88 میلی لیتر آب مقطر استفاده گردید.
3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید
6/87 گرم آکریل امید با 4/2 گرم بیس آکریل آمید را در 300 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و پس از فیلتر کردن در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
3-2-15- تهیه بافر SDS
برای تهیه ی 10 میلی لیتر از این بافر، 10 گرم SDS را در 5 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و سپس به حجم 10 میلی لیتر رساندیم. این محلول در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer)
95/5 گرم HEPES، 84/5 گرم NaCl و 36/1 گرم Imidazole را در 1 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 ، 100 و 10 میلی مولار باشد سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم(PH7.5 ).
3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer
95/5 گرم HEPES، 84/5 گرم NaCl و 68 گرم Imidazole را در 1 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 ، 100 و 1000 میلی مولار باشد، سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کردیم(PH7.5 ).
3-2-18- تهیه بافر دیالیز
68/15 گرم Tris-Hcl و 36/23 گرم NaCl را در 4 لیتر آب مقطر حل کرده تا غلظت نهایی به ترتیب 25 و 100 میلی مولار باشد، سپس محلول را در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری نمودیم (PH 7.5 ).
3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl)
25/48 گرم گوانیدین هیدروکلراید را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کردیم تا غلظت نهایی به 8 مولار برسد.
3-2-20- تهیه استوک فلزات
کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب و نیترات نیکل را در آب مقطر یا بافر دیالیز حل کرده، استوک 1 و 2 مولاری تهیه کردیم. در یخچال در 4- درجه سانتیگراد، نگهداری شدند.
3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری
محیط کشت LB Broth
محیط کشت LB Broth را در حجم یک لیتر با اضافه کردن 20 گرم پودر LB تهیه کردیم، سپس اتوکلاو کرده و پس از خنک شدن با اضافه کردن مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک مورد استفاده قرار دادیم.
محیط کشت LB Agar
محیط کشت LB Agar را در حجم 250 میلی لیتر با اضافه کردن 5 گرم LB و 75/3 گرم آگار تهیه کردیم، سپس اتوکلاو نموده و پس از خنک شدن با اضافه نمودن مقدار مناسبی از آنتی بیوتیک، محیط را داخل پلیت ریخته و از آن جهت محیط کشت جامد باکتری استفاده کردیم.
3-3- روش انجام کار
3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید .pLEICS-01 تصویر A نشان دهنده توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b و تصویر B نشان دهنده نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01است. این پلاسمید به پروتئین در ناحیه N-terminal دنباله هیستیدینی اضافه می کند ((His6-tag. وکتور دارای ناحیه برش آنزیمیTEV پروتئاز جهت برداشتن دنباله هیستیدینی از پروتئین است. هم چنین وکتور شامل آغاز کننده T7 و خاتمه دهنده T7 است.
3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب
3-3-2-1- تهیه ی سلول های پذیرا competent cells))
بدین منظور ابتدا محلول های زیر را آماده کردیم.
10 میلی لیتر محیط کشت استریل LBبدون آنتی بیوتیک تهیه کردیم. همچنین محیط کشت SOB حاوی 2 گرم تریپتون، 5/0 گرم عصاره مخمر، 05/0 گرم NaCl را در 95 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و نیز 1 میلی لیتر KCl میلی مولار اضافه نمودیم و PH محلول را برابر با 7 تنظیم کردیم و حجم نهایی را

ساختار ثانویه ای مشابه با حالت NATIVE است که این امر توسط تکنیک دورنگ نمایی حلقوی با تعیین درصد محتوای آلفا هلیکس، صفحه های بتا و راندوم کویل ها تایید شده است (128).
شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید. ترکیباتی که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند.
2-9-6-4- روش دناتوراسیون دمایی
یک چارچوب ترمودینامیکی مشخص برای دناتوراسیون دمایی وجود دارد که بیان کننده ی وابستگی انرژی آزاد گیبس به درجه حرارت می باشد. از نظر عملی روش دناتوراسیون دمایی بسیار مناسب است به این دلیل که حین انجام این آزمایش نیاز به تغییر در ترکیب نمونه تحت آزمایش نمی باشد. هرچند نمی توان از این امر چشم پوشی کرد که بسیاری از پروتئین ها با بالا رفتن دما تمایل به جمع شدن و تشکیل رسوب را در نمونه پیدا می کنند و ترکیب نمونه را تحت تاثیر قرار می دهند (129).
2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب
2-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب
پروتئین ها در بدن دارای نقش بسیار مهم و گسترده ای در فرآیندهای بیولوژیک، انتقال مواد به درون سلول ها و بیرون از آن، تشکیل گیرنده های سلولی، تسریع واکنش های بیوشیمیایی و فرآیند پیام رسانی بر عهده دارند. تاکنون ۲۵۰۰۰ الی ۴۰۰۰۰ ژن در بدن انسان تخمین زده شده است و با برآورد نقش ژن ها و تعداد زیادی از پروتئین های حیاتی که خود بر مبنای تغییرات ساختمانی مولکول های بسیار زیادی را تولید می کنند می توان به تعداد بیشتر آنها در بدن پی برد.
2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 
روش های تولید پروتئین های نوترکیب به عنوان روش های مورد نیاز و اساسی در علم بیوتکنولوژی امکان تولید بسیاری از مولکولهای حیاتی مانند داروها، انسولین و پروتئین های خون، هورمونها مثل هورمون های رشد و واکسن ها و غیره را فراهم می نماید. برای تولید پروتئین های نوترکیب از تکنیک های کلونینگ مولکولی استفاده می شود که در آن ژن مورد نظر توسط حامل هایی به نام وکتور درون باکتری های مخصوصی وارد شده تا به عنوان جزئی از ژن باکتری و به همراه آن تکثیر شده و پروتئین مورد نظر همراه با سایر پروتئین های باکتری بیان شود. سپس با روش های مختلف کروماتوگرافی ستونی پروتئین ها خالص سازی شده و خصوصیات آن از لحاظ فعالیت بیولوژیکی و ساختمانی با روش هایی مانند روش ELISA مورد بررسی قرار میگیرد. پس از طی مراحل ذکر شده پروتئین مذکور به عنوان دارو، مکمل یا در زمینه های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرد (130).
محصولات نوترکیب که با دستکاری های ژنتیکی و تغییرات  DNAدر موجودات مختلف همراه است موجب تحول عظیمی در نوع و تنوع فرآورده های دارویی مورد مصرف شده است به طوریکه امروزه شاهد مصرف فرآورده های نوترکیب دارویی با وزن مولکولی بالا به جای مولکول های شیمیایی کوچک دیروز هستیم. داروهای پروتئینی دارای عملکرد بسیار اختصاصی هستند، لذا بر روی سایر فرآیندهای بیولوژیک غیر مرتبط اثر سوئی نخواهند گذاشت و از این نظر کمتر دارای عوارض جانبی هستند (شکل 31).
شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا.
دو مزیت که برای پروتئین های درمانگر وجود دارد سبب شده تا دور نمای اقتصادی بسیار جالبی برای آنها نسبت به داروهای متداول ترسیم شود. اکثر داروهای پروتئینی حاصل فناوری DNA نوترکیب است مگر برخی از موارد کم مانند آنزیم های پانکراس و یا مهار کننده های آلفا-یک پروتئاز که از استخراج بافت های حیوانی و پلاسمای انسانی بدست می آید. سیستم های بیولوژیکی که از آن ها پروتئین های نوترکیب بدست می آیند عبارت از انواع باکتری ها، مخمرها، سلول های جانوری و حشرات و گیاهی و سلول های حاصل از حیوانات دستکاری شده ژنتیکی میباشد. مرحله دیگری که از این پروتئین ها میتوان فرآورده های اصلاح شده بدست آورد عبارت است از بهینه کردن آن ها بر مبنای گلایکوزیله کردن، فسفریلاسیون و تجزیه پروتئولیتیک. بطور مثال باکتری ها نمیتوانند واکنش های گلایکوزیله شدن انجام دهند. لذا بر مبنای هر یک از تغییرات فوق میتوان پروتئین اصلاح شده ای را با مزایای بیشتری بدست آورد(131).
مولکول انسولین اولین دارویی بود که بر مبنای آن تمایل به تغییرات و بهینه سازی آن ایجاد شد. سابق بر این انسولین حاصل استخراج و خالص سازی از پانکراس بود و این نوع فرآورده ها حداقل سه عدم مزیت را با خود داشت. اول آنکه محدودیت حیوانی برای استخراج برای آنها وجود دارد و دوم اینکه هزینه این نوع استخراج از حیوان زیاد و نیازمند صرف وقت بوده و اینکه در برخی مواقع نسبت به این نوع فرآورده ها آلرژی همراه با پاسخ عدم تحمل پذیری وجود دارد .
این محدودیت ها باعث شد تا تحقیقات بر مبنای جدا سازی ژن تولید کننده انسولین انسانی حاصل صورت گیرد و سپس ژن مدنظر در E.Coli  با مهندسی ژنتیک وارد شود که سبب تولید انسولین انسانی از طریق فناوری DNA  نوترکیب گردید. در نهایت این فناوری موجب شد تا انسولین انسانی با مزایای کم هزینه تر و در دسترس تر و با حالت خطر کمتر و با ایمنی زایی همراه به طور صنعتی تهیه شود (132).
پروتئین های نوترکیب نسبت به سایر پروتئین ها دارای مزیت هایی هستند. یکی از این مزیت ها آن است که نسخه کپی شده و بازنویسی شده از ژن انسانی میتواند همانند دقیقی از ترکیب طبیعی بدن باشد و بطور اختصاصی عمل نماید و نسبت به آن نیز واکنش ایمنی کمتری در بدن داشته باشد. ثانیا پروتئین های نوترکیب بطور موثرتر و با هزینه کمتری و با فراوانی بیشتری تولید میشوند. یکی از موارد کاربرد فرآورده های نوترکیب در درمان بیماری گوشه Gaucher’s disease)) است. این عارضه ژنتیکی و نقص متابولیکی لیپیدی در اثر کمبود آنزیم بتا گلوکوروسربروزیداز بوجود می آید و سبب بزرگ تر شدن کبد و طحال می گردد و در پوست بدن نیز زخم هایی همراه رنگ دانه هایی ایجاد می شود. این آنزیم در ابتدا از جفت انسانی استخراج و حاصل می شد. برای درمان یک بیمار در سال نیاز بود تا این آنزیم از ۵۰۰۰۰ جفت انسانی استخراج و خالص سازی شود که از نظر عملی کار بسیار زیادی لازم بود. آنزیم بتا گلوکوروسربروزیداز بصورت نوترکیب تهیه شد و این آنزیم با این فناوری نه تنها به حد کافی تولید میشود بلکه خطر انتقال عوامل ویروسی نیز از بین رفت (133).
2-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان 
از آنجائیکه یک ژن می تواند در سیستم های گوناگونی بیان گردد، بنابراین تعیین سیستمی با بیشترین بازده تولید پروتئین های نوترکیب امری ضروری در نظر گرفته می شود. تعیین بهترین سیستم بیان کننده پروتئین های نوترکیب یکی از مباحث مهم در بیوتکنولوژی است. یک سیستم بیان کننده پروتئین های نوترکیب باید بتواند مواد زیستی را با بیشترین فعالیت بیولوژیکی و ایمنی و کمترین هزینه تولید کند. در حال حاضر بعضی از شرکت های معروف برای تولید پروتئین های نوترکیب از سیستم های فرمانتاسیون باکتری ها (مانند E. coli) یا سلول پستانداران استفاده می کنند. اما این سیستم ها دارای محدودیت هایی هستند. سیستم های بیانی که جهت تولید پروتئین های نوترکیب از سلول های پستانداران استفاده می کنند، فرآورده های را به وجود می آورند که کاملاً مشابه آن هایی است که بطور طبیعی در بدن انسان سنتز می شوند. 
اما چون کشت این سلول ها گران تمام می شود، این سیستم در مقیاس محدود قابل اجرا است. کاربرد میکروارگانیسم ها مانند باکتری ها باعث می گردد که پروتئین های نوترکیب در مقیاس وسیع تولید شوند؛ اما مهمترین مشکل این سیستم ها این است که فرآورده های حاصل به طور محسوسی با فرآورده های طبیعی انسانی اختلاف دارند. برای مثال، پروتئین هایی که معمولاً در انسان گلیکوزیله می شوند، به وسیله باکتری ها گلیکوزیله نمی گردند، زیرا باکتریها فاقد امکانات سلول های یوکاریوتی جهت انجام اصلاحات پس از ترجمه هستند. پردازش پس از ترجمه برای فعالیت زیستی تعداد زیادی از پروتئین های انسانی از جمله آنتی بادی ها لازم است. گیاهان واریخته جایگزین مناسبی برای سیستم های رایج بیان کننده پروتئین های نوترکیب همچون کشت سلول های جانوری و پروکاریوتی هستند. گیاهان واریخته دارای ژن یا ژن هایی هستند که بطور مصنوعی به آن ها الحاق شده است. آزمایش های پزشکی نشان می دهند که پروتئین های تولید شده در گیاهان از نظر فعالیت های زیست شناختی و ساختمانی با پروتئین های مشابه که از سیستم های کشت سلول های انسانی و حیوانی بدست آمده اند، قابل مقایسه هستند (135-134).
2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین
رایج ترین ارگانیسم مورد استفاده برای بیان پروتئین ها باکتری ایشریشیاکلی است. تمام مواردی که موجب افزایش بیان پروتئین در ایشریشیاکلی می شوند در سیستم های بیانی دیگر نیز بکار گرفته می شوند. عواملی نظیر سرعت رشد بالا، آسانی کار با این میکروارگانیسم، رشد در محیط کشت نسبتا غنی و بی ضرر بودن برای انسان و یا محیط زیست کار با این میکروارگانیسم را آسان می کند (136).
شکل 32: استفاده ازاشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین.
2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب
زمانی که میزان بالایی از پروتئین داخل سلول تولید شد برای اینکه بتوان جزئیات پروتئین بیان شده را مورد مطالعه قرار داد نیاز است که خالص سازی پروتئین در سطح مطلوبی صورت بگیرد. این بدان معنی است که می بایست پروتئین های مورد نظر ما از سایر اجزای سلول از جمله تمام پروتئین های دیگر جدا شود. تخلیص پروتئین یک فرآیند پیچیده می باشد و نیاز به درجه بالایی از مهارت و تجربه دارد، همچنین پروتکل های تخلیص پروتئین اغلب با تلاش بی وقفه بدست آمده و تست شده اند. اکثر پروتکل ها تکیه بر پیدا کردن ویژگی خاصی از پروتئین ها دارند که می تواند به تدریج پروتئین مورد نظر را از تمام پروتئین ها و اجزای دیگر سلولی تفکیک کند. استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی یک روش تخلیص پروتئین است. این روش به طور گسترده برای طیف وسیعی از پروتئین هایی با خواص متفاوت قابل اجرا است. در کروماتوگرافی میل ترکیبی، اضافه نمودن اسید آمینه های خاص به پروتئین یک ویژگی جدید می دهد که موجب اتصال محکم آن به یک ماده خاص می گردد. یک مثال رایج استفاده از “His tag” برای کمک به خالص کردن یک پروتئین است. این تگ یک رشته (معمولا شش تا) از رزیجوهای هیستیدین است که به پایانه N و یا پایانه C پروتئین ها اضافه می گردد. همچنین در حال حاضر پلاسمیدهایی به صورت تجاری در دسترس هستند که حاوی کدون خود تگ می باشند. حضور این آمینواسید های اضافی در پروتئین اغلب هیچ گونه تداخلی با عملکرد طبیعی پروتئین ندارد و موجب اتصال محکم پروتئین به یونهای فلزی مانند نیکل می شود. به صورت تجاری رزین های که به یون فلزی نیکل اتصال دارند جهت تخلیص پروتئین های دارای تگ هیستیدین مورد استفاده قرار می گیرند. در روش کروماتوگرافی میل ترکیبی سلول های ای کلای از ستون حاوی رزین های نیکل عبور داده می شود و پروتئین های داری تگ هیستیدین به یون نیکل متصل می گردند، سپس برای آزاد شدن این اتصال از بافر ایمیدازول استفاده می گردد(137).
هدف از انجام این پایانامه بیان و تخلیص پروتئین نوترکیبFGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم می باشد. قابل ذکر است که تهیه ی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین FGFR2b به صورت خالص این امکان را فراهم می کند که در مطالعات بعدی بتوان اطلاعاتی راجع به ساختار و نیز بررسی برهمکنش پروتئین و لیگاند از جمله اثر مهارکننده های مختلف را روی ناحیه ی کینازی این پروتئین

با دومین های protein متصل به z-f مشاهده شده است. اثرات مختلفی از جمله جابجایی z-f، تشکیل کمپلکس های ترکیبی، اکسیداسیون رزیدوهای سیتئین در دومین های متصل به فلز مشاهده شده است. تاخوردن نامناسب دومین های z-f با فقدان عملکرد درست protein همراه است. مختل شدن ساختارهای z-f ممکن است منجر به تداخل در پروسه های متعدد سلولی درگیر در بیان ژن، تنظیم رشد و حفاظت یکپارچه ژنومیک شود. همچنین این فلزات از طریق اثر بر روی فعالیت XPA و Fgp، دو پروتئین z-f موثر در ترمیم DNA باعث مهار ترمیم حذف نوکلئوتید و مهار ترمیم حذف باز می شوند (105).
2-8-3- نیکل
– یکی از مکانیسم های احتمالی آپوپتوز و سرطان های ناشی از نیکل، القاء ROS توسط ترکیبات نیکل است. ROS تولید شده در مسیرهای سیگنالینگ Akt (پروتئین کیناز B) درگیر است (شکل 25).
Akt سرین/تره اونین کینازها، یکی از تنظیم کننده های اصلی عمل زنده ماندن سلول در پاسخ به تحریک فاکتور رشد است. اعتقاد عمومی بر این است که این کینازها از طریق فسفوریلاسیون و مهار تعدادی از پروتئین های تنظیم کننده آپتوز، ضد آپپتوز هستند. گزارش شده است که کیناز 1 تنظیم کننده سیگنال آپپتوز (ASK1) توسط Akt در سرین 83 فسفریله می شود و فعالیتش کاهش می یابد.
ASK1، یک سرین تره اونین کیناز است که به عنوان یک پروتئین کیناز کیناز کیناز فعال کننده میتوژن (MAPKKK)، در پروتئین کیناز c-Jun N-terminal kinase/stress-activated (JNK/SAPK) و آبشارهای سیگنالینگ p38 MAPK در ابتدا کشف شد. امروزه، تحقیقات اصلی بر Akt، بر نقش آن در پیشرفت رشد سلول فوکوس کرده است. در مورد عملکردش در آپپتوز سلولی شناخت کمی وجود دارد. مطالعات اخیر خاطر نشان کرد که نیکل القاء کننده ROS، Akt را فعال می کند، که از طریق فسفوریلاسیون Thr838، سبب فعال شدن ASK1 می شود که منجر به فعالیت پایین دست p38 MAPK شده و سرانجام سبب آپپتوز سلولی می شود(107-106).
شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ.
– نیکل در انسان و حیوان یک سرطانزا می باشد که اثر اولیه شروع پروسه اش در گسترش سرطان ریه است. فلزات واسطه می توانند به DNA از طریق رادیکال های آزاد تولید شده توسط واکنش فنتون، آسیب برسانند.
پروتئین های انگشت روی به عنوان عوامل رونویسی ای که به طور خاص به توالی های کوتاه DNA متصل شده اند و کنترل رونویسی از تعدادی ژن را به عهده دارند، عمل می کنند.
آزمایشات نشان داده اند که فلزات مانند کبالت، کادمیم، مس، نیکل و آهن ممکن است به جای روی، در پروتئین انگشت روی جایگزین شوند. یک مکانیزم مهم سرطانزایی این فلز واسطه، افزایش پردازش اکسیداسیون احیاء سلولی توسط فلزات است. با جایگزینی اکسیداسیون احیای فلز به جای روی در پروتئین انگشت روی، انتظار تولید رادیکالهای آزاد است که ممکن است باعث تخریب DNA شود(109-108).
– اثر خارج سلولی نیکل که ممکن است در سرطانزایی آن نقش داشته باشد، تغییر در اتصال نرمال DNA-pr است. از آنجایی که تنظیم همانندسازی DNA و بیان ژن به تعاملات DNA-pr بستگی دارد، اثر نیکل در تغییر وسیع اتصال DNA-pr، ممکن است در تنظیم مداخله کند و منجر به فعالیت سرطانزایی ترکیبات نیکل شود(110).
– فعالیت پایدار NF-kB بوسیله مسیرهای سیگنالینگ فعال شده توسط فلز، می تواند منجر به فرآیندهای التهابی مزمن و بیماری های مرتبط، از جمله سرطان شود. تولید TNF-a, IL-1 B, IL-6 و IL-8 به علت نقش مهم آنها در بیماریهای التهابی مزمن و بیماریهای اتوایمیون افزایش پیدا کرد و سرانجام سبب توسعه سرطان شد. نتایج به دست آمده نشان داد که روی، نیکل و کادمیوم به میزان قابل توجهی NF-kB را فعال می کنند و کموکین IL-8 را انتشار می دهند (111).
– نیکل از طریق مسیرهای سیگنالینگ مختلف موجب بیان CCR7 (رسپتور کموکاین) در سلولهای دندرتیک انسان می شود. نیکل مستقیما بیان CCR7 را از طریق P38 MAPK و فعالیت JNK، فعال می کند(112).
– مطالعات نشان داد که، بیان پروتئین c-Myc بوسیله یونهای نیکل درسلولهای اپیتلیال نایژه ای انسان غیر توموری(Beas-2B) و سلولهای کراتینوسایت T افزایش می یابد. مطالعات همچنین نشان داد که یونهای نیکل در سلولهای Beas-2B سبب القاء آپپتوز می شوند. از بین بردن c-Myc در سیستم سلولی موش، اهمیت نقش c-Mycرا در آپپتوزهای القاء شده توسط یون فلز نشان داد. یون نیکل c-Myc موجود در Beas-2B را از طریق مسیر MEK/ERK تنظیم می کند. در مجموع، نتایج نشان می دهد که القاء c-Myc طراحی شده توسط یون نیکل از طریق یک مسیر وابسته به ERK رخ می دهد و نقش بسیار مهمی در آپپتوز ناشی از نیکل در سلولهای Beas-2B دارد(113).
2-8-4- آلومینیوم
– به صورت مزمن در معرض آلومینیوم بودن، به طور قابل توجهی میزان فعالیت PKC و MAPK را کاهش می دهد و میزان بیان ERK1/2 و CaMKII را در هیپوکامپوس کم می کند، LTP ناحیه CA1 هیپوکامپال، سبب ترمیم تواناییهای حافظه در موش ها می شود(114).
– با استفاده از سلول های سالم تحریک شده توسط فلوراید، آلومینیوم سبب کاهش تشکیل اینوزیتول فسفات به صورت وابسته به دوز می شود. در سلول های digitonin permeabilized، تحریک با GTP غیر قابل هیدرولیز، تشکیل فسفات اینوزیتول نیز با افزایش دوز آلومینیوم مهار شد. مانند مسیر حدواسط Ca+2، آلومینیوم باعث کاهش آزاد شدن IP3 می شود. در نتیجه آلومینیوم به عنوان یک عنصر اساسی برای انتقال سیگنال همراه فسفواینوزیتید، عمل می کند(115).
– آبشار سیگنالینگ فسفولیپید(شکل 26) یک سیستم اصلی در ترانسداکشن سلولی است و با سایر مکانیسم های سیگنال ترانسداکشن قرابت دارد. این آبشار شامل تعامل بین تولید پیامبرهای ثانویه و پروتئین های مختلف مانند کانالهای یونی، پروتئینهای کینازی و پروتئینهای سیگنالینگ است. نتیجه این تعامل ها می تواند متابولیسم را تغییر دهد. فسفاتیدیک اسید(PA) در آبشارهای سیگنالینگ و همچنین در بیوسنتز فسفولیپید پیشگام است. طبق تحقیقات، آلومینیوم اثرات مهاری بر روی PA در نتیجه بر روی سیگنالینگ فسفولیپید دارد. مهمترین مسیرهای تشکیل PA در سیگنالینگ گیاهان، فسفولیپاز C (PLC)، دی اسیل گلیسرول کیناز (DGK) و فسفولیپاز D (PLD) است. تاثیر Al بیشتر بر روی مسیر PLC/DGK می باشد(116).
شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید.
2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها
داشتن اطلاعات درباره جزئیات ساختمان سه بعدی یک پروتئین برای توسعه درک عملکرد آن ضروری است. متاسفانه در مقایسه با تعداد بسیار زیاد توالی های شناخته شده، ساختمان تعداد کمی از پروتئینها شناخته شده است. با رشد بیشتر شکاف بین توالی ها و ساختمان های شناخته شده، نیاز به توسعه روشهای پیشگویی ساختمان که قابل اعتماد باشند افزایش یافته ‌است، بویژه برای پروتئینهایی که تعیین ساختمان آنها به طریق تجربی ممکن نباشد و پروتئینی با توالی مشابه با آن که ساختمانش شناخته شده باشد نیز یافت نشود. بعلاوه روشهای پیشگویی موفق، به روشن شدن رابطه بین توالی اسیدهای آمینه و ساختمان پروتئین ها کمک میکند و میتواند به طراحی پروتئینهای جدید و مهندسی آنها کمک کند.
2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها
ساختارهای اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین ها را می توان با روشهای بیوانفورماتیک بدست آورد. ساختار دوم با روش CD و FTIRو ساختار سوم با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، می تواند مشخص شود(117).
2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها
اغلب پروتئین ها دارای توالی متشکل از ترکیب بیست نوع ال-اسیدآمینه که در طبیعت یافت می شوند هستند. در این بین تنها سه اسید آمینه ی ضروری تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین (شکل27)، قادر به جذب انرژی فرابنفش در طیف الکترومغناطیسی می باشند و تا حد زیادی خواص منحصر به فرد اسپکترال پروتئین ها به این سه اسید آمینه نسبت داده شده است. این سه اسیدآمینه طول موج جذب و نشر متفاوتی دارند. تریپتوفان نسبت به تیروزین و فنیل آلانین خاصیت فلوئورسانس بیشتری دارد (جدول2)، هرچند خواص فلوئورسانس تریپتوفان وابسته به محیط می باشد. به عنوان مثال زمانیکه قطبیت محلول کاهش پیدا می کند متعاقب آن طیف فلوئورسانس به سمت طول موج کوتاهتر شیفت می یابد و شدت نشر فلوئورسانس هم افزایش می یابد. این به این دلیل است که ریشه های تریپتوفان بیشتر داخل نواحی هیدروفوبیک پروتئین می شود و موجب ایجاد یک شیفت در طیف نشری می گردند. این پدیده در مطالعات دناتوراسیون پروتئین ها استفاده می شود (118). بنابراین بر حسب تعداد این سه اسید آمینه و نیز محل قرار گیری آن ها در یک پروتئین، این سه اسید آمینه می توانند اطلاعاتی درباره ی ساختار پروتئین فراهم کنند. خواص اسپکترال این اسیدآمینه ها به طور خالص در محلول بررسی شده است. از این خواص طیفی برای تعیین ویژگی های جذبی پروتئین ها در حالت طبیعی و فولد شده در مقایسه با حالت غیرطبیعی و دناتوره شده در حضور گرما برای مشخص شدن میزان پایداری استفاده شده است (119).
شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین.
جدول2: خصوصیات فلوئورسانس اسیدآمینه های آروماتیک.
2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها
2-9-3-1- تاخوردگی(Folding) پروتئین ها
برای اینکه یک پروتئین بتواند به درستی عملکرد های بیولوژیکی خود را انجام دهد باید پایدار و به خوبی فولد شده باشد. گرچه اطلاعات بسیاری درمورد کنفورماسیون و نحوه ی سنتز بیولوژیکی پروتئین ها موجود است اما با این حال در مورد ساختار آن ها و نیز نحوه ی فولد شدن پروتئین ها اطلاعات کمی وجود دارد. همچنین تعیین ویژگی های ساختاری پروتئینی که نیمه فولد شده یعنی زمانی که پروتئین در مرحله ی حدواسط در فرآیند فولد شدن پروتئین ها قرار دارد برای درک مکانیسم فولدینگ اهمیت حیاتی دارد. به این دلیل که ماهیت تعاونی فرآیند فولدینگ اجازه نمی دهد که پروتئین نیمه تاخورده در شرایط حد واسط بیشتر از چند دقیقه در شرایط تعادل و پایدار باقی بماند از این رو مطالعات کینتیکی برای تشخیص حد واسط ها نیاز است. با این حال نشان داده شده که تعدادی از پروتئین ها تحت شرایط دناتوراسیون قادرند پروتئین نیمه تاخورده ی مرحله ی حد واسط خود را به صورت پایدار نشان دهند. شواهدی وجود دارد که نشان میدهد این حد واسط ها که اصطلاحا کره ی مذاب نامیده می شوند در فرآیندهای کینتیکی قابل تشخیص هستند. با این حال بازهم جزئیات مولکولی آن ها را به سختی می توان به طور تجربی حتی در شرایط تعادل مشخص کرد. فقدان اطلاعات در مورد تشکیل حد واسط ها فرآیند تاخوردگی مجدد پروتئین های دناتوره شده را به حالتی که از نظر عملکرد بیولوژیکی طبیعی است بسیار پیچیده می کند. پیچیدگی این فرآیند در مورد مولتی دومین پروتئین بیشتر می باشد (120).
2-9-3-2- مطالعه ی تاخوردگی(Folding) مولتی دومین پروتئین ها
آنالیز ژنوم گویای این مطلب است که بخش قابل توجهی از پروتئین ها بیش از یک دومین دارند. جزئی از پروتئین که دارای ساختار و عملکرد مجزا است و اغلب به صورت مجزا بیان می شود دومین نامیده می شود. برای مثال لایزوزیم با اینکه دو دومین ساختاری دارد اما به عنوان یک پروتئین تک دومین شناخته می شود، به این دلیل که هیچ یک از دومین ها به تنهایی پایدار نیستند. علاوه براین، این تعریف شامل پروتئین های ساخته شده از واحدهای تکراری کوچک که به تنهایی نمی توانند بیان شوند نمی شود. حدود 40 تا 65 درصد پروکاریوت ها حاوی پروتئین های چند دومینی می باشند که این درصد در یوکاریوت ها 65 تا 80 درصد است. در یک پروتئین مولتی دومین، دومین ها با یک اتصال دهنده ی کوتاه و ساختاری و یا یک اتصال دهنده ی بلند و انعطاف

پذیر به هم مرتبط می شوند، همچنین خود این اتصال دهنده ها ممکن است در عملکرد پروتئین دارای نقش مهمی باشند. به طور کلی پیچیدگی فرآیند آنفولدینگ در پروتئین هایی که بیش از یک دومین دارند دیده می شود. این پیچیدگی به این دلیل است که هر دومین می تواند به طور مستقل از دومین دیگر آنفولد شود. برای مطالعه ی دناتوراسیون و فولدینگ مولتی دومین پروتئین ها تکنیک های متفاوتی وجود دارد. طیف سنجی فلوئورسانس یک ابزار قابل اعتماد در مطالعه ی پروتئین هاست. این روش حساسیت و انتخاب پذیری بالایی دارد. تکنیک های دیگر شامل دورنگ نمایی حلقوی و روش پراکنـدگی دینامیـکی نور  (DLS) و غیره می باشند (122-121).
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی
برای اولین بار فلوئورسانس در اواسط قرن 19 توسط سرجان فردریک ویلیام هرشل مطرح شد. فلوئورسانس در واقع شکل ویژه ای از لومینه سانس است. مشخصه ی آن آزاد شدن یک فوتون از مولکولی است که در حین انتقال از حالت برانگیخته به حالت پایه می رسد. این آزاد شدن انرژی با سرعتی معادل با s-1 108 رخ می دهد. انواع فرآیند های فعال و غیرفعال سازی فلوئورسانس در شکل 28 که دیاگرام جابلونسکی (Jablonski Diagram) گفته می شود، نشان داده شده است (این دیاگرام حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها را نشان می دهد).
مراحل اصلی ذکر شده در نمودار به تفصیل در زیر آمده است:
مرحله ی جذب :(Absorption) جذب با تحریک بسیار سریع اتفاق می افتد ( 15-10 ثانیه). انتقالات جذبی از حالت پایه ارتعاشی در تراز الکترونی یکتایی پایه (S0) به ترازهای مختلف ارتعاشی در اولین و دومین حالت الکترونی برانگیخته ( S2و (S1 در شکل نشان داده شده است.
مرحله ی آسایش ارتعاشی :(Vibrational Relaxation) این فرآیند نوعی آسایش غیرتابشی است. ملکول های موجود در حالت های ارتعاشی برانگیخته به سرعت انرژی اضافی ارتعاشی خود را از دست داده و به سطح ارتعاشی پایه در تراز الکترونی مربوطه می روند. انرژی در این حالت به صورت گرمایی یا حرکات ارتعاشی مولکول های حلال از دست می رود. به طور طبیعی آسایش ارتعاشی به صورت گام به گام اتفاق می افتد و شرط انتقال از تراز ابتدایی (νi) به تراز نهایی (νf) رابطه Δν=1 می باشد. این بدان مفهوم است که براثر هر برخورد ملکول با ملکول های حلال، که منجر به غیرفعالسازی غیرتابشی می شود، مولکول برانگیخته یک کوانتوم انرژی ارتعاشی خود را از دست داده و صرفا انتقال به یک تراز انرژی پایین تر در مرحله رخ می دهد. مدت زمان انجام این فرایند 10-10 تا 11-10 ثانیه می باشد.
مرحله ی تبدیل درونی :(Internal Conversion) انتقال الکترون بین دو تراز الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است که به شیوه غیرتابشی صورت می گیرد. شرط انجام این فرآیند همپوشانی نمودارهای انرژی پتانسیل دو تراز الکترونی است، به نحوی که انرژی حالت ارتعاشی پایین تر تراز الکترونی بالاتر و حالت ارتعاشی بالاتر تراز الکترونی پایین تر با هم برابر باشد. این فرآیند می تواند بین دو حالت برانگیخته رخ دهد (S2→S1) و یا بین اولین حالت الکترونی برانگیخته و حالت الکترونی پایه (S1→S0) اتفاق بیافتد. مدت زمان انجام این فرآیند بین حالت های الکترونی برانگیخته، 12-10 ثانیه است. تبدیل درونی از یک حالت برانگیخته الکترونی به حالت الکترونی پایه (S→S0) وابسته به نوع ملکول بوده ولی معمولا در صورتی که تفاوت انرژی زیادی بین S و S0 وجود داشته باشد، کارایی کمتری دارد. بنابراین هیچ گونه هم پوشانی بین چاه های انرژی پتانسیل دو حالت وجود نخواهد داشت. بعد از تبدیل درونی، انرژی اضافی به سرعت از دست رفته و مولکول در پایین ترین سطح ارتعاشی حالت الکترونی پایین تر قرار می گیرد.
مرحله ی فلوئورسانس: انتقال تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است. در مورد بیشتر مولکول ها، الکترون ها در حالت پایه جفت می شوند(با اسپین های مخالف)، بنابراین فلوئورسانس شامل یک انتقال یکتایی-یکتایی است. با توجه به این که تبدیل درونی به تراز S و آسایش ارتعاشی بعد از آن بسیار سریعتر از فلوئورسانس است، فلوئورسانس معمولا از پایین ترین تراز ارتعاشی S به حالت های ارتعاشی مختلف در تراز الکترونی پایه صورت می گیرد. بنابراین حتی اگر جذب به حالت های مختلف یکتایی برانگیخته صورت گرفته باشد تنها یک باند فلوئورسانس دیده می شود. به طور معمول مدت زمان فلوئورسانس 6- 10 ثانیه است. باندهای فلوئورسانس مولکولی عمدتا از خطوطی تشکیل شده که طول موج بلندتر یا فرکانس کمتری (انرژی کمتر) نسبت به باند جذبی خود دارند. شیفت به طول موج های بلندتر، شیفت استوک (Stokes Shift) نیز خوانده می شود.
مرحله ی تبدیل بیرونی :(External Conversion) نوعی آسایش غیرتابشی است که در آن حالت های برانگیخته انرژی اضافی خود را به سایر گونه ها (مثل حلال یا مولکول های حل شونده) می دهند. یکی از مکانیزم های تبدیل بیرونی، خاموشی برخوردی یا دینامیک (Dynamic or Collisional Quenching) است. در این نوع خاموشی، طی برخورد انرژی از گونه برانگیخته به سایر مولکول ها منتقل می شود. بنابراین سرعت خاموشی دینامیک با سرد کردن نمونه کاهش می یابد.
مرحله ی عبور بین سیستمی :(Intersystem Crossing) انتقالات جذبی از حالت های یک تایی به سه تایی ممنوع است. هر چند جذب ضعیفی در مورد برخی مولکول ها امکان پذیر است. تراز برانگیخته سه تایی همچنین می تواند از طریق انتقال الکترون از ترازهای یکتایی برانگیخته پر شود. به این فرآیند، عبور بین سیستمی گفته می شود. این فرآیند مشابه تبدیل درونی است، با این تفاوت که انتقال الکترون بین ترازهایی که چندگانگی متفاوت دارند انجام می شود. بعد از عبور بین سیستمی، مولکول با آسایش ارتعاشی به پایین ترین حالت ارتعاشی در تراز الکترونی که در آن قرار دارد می رود.
مرحله ی فسفرسانس:  به طور معمول تراز های سه تایی که از الکترون پر شده اند به وسیله تبدیل بیرونی و یا عبور بین سیستمی به تراز الکترونی پایه غیرفعال می شوند .(T1→S0) تراز های سه تایی می توانند به وسیله نشر یک فوتون نیز غیرفعال شود. غیر فعال سازی تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی متفاوت، فسفرسانس خوانده می شود. معمولا مدت زمان انجام فسفرسانس 4-10ثانیه می باشد. بیشتر بودن طول عمر فسفرسانس به دلیل غیرمجاز بودن آن به لحاظ اسپینی است (تغییر چندگانگی اسپین در خلال انتقالات از دیدگاه کوانتمی غیر مجاز است). بنابراین تنها زمانی که احتمال وقوع تبدیل بیرونی با سرد کردن نمونه کاهش یابد فسفرسانس رخ می دهد. طول موج فسفرسانس یک ترکیب مشخص معمولا بلندتر از طول موج فلوئورسانس است، به این دلیل که انرژی T1  از انرژی S1 کمتر است (123).
شکل28: دیاگرام جابلونسکی. حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها.
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD)
روش طیف سنجی CD به طور گسترده ای در ارزیابی ساختار و پایداری پروتئین ها در شرایط مختلف محیطی از نظر دما، قدرت یونی، وجود املاح و مولکول های کوچک مورد استفاده قرار می گیرد. در حال حاضر انجام این تکنیک بدلیل اینکه نسبتا آسان است و نیاز به مقدار کمی از نمونه دارد و هم چنین تجزیه و تحلیل داده ها سریع می باشد، تقریبا در همه آزمایشگاه های درگیر با تجزیه و تحلیل پروتئین ها به طور عمده فراهم است. این تکنیک عمدتا برای مطالعه ساختار دوم پروتئین ها استفاده می شود، هر چند از آن می توان برای مطالعه ساختار پپتیدها و نوکلئیک اسیدها نیز استفاده نمود. مطالعه پروتئین ها با این تکنیک حتی با یک غلظت پایین نمونه (10 – 1 میلی گرم / میلی لیتر) در یک گسترده وسیعی از متغیرهای محیطی (دما، pH، و غیره) قابل انجام است. هم چنین این روش می تواند اطلاعاتی را در مورد اثر لیگاندهای اضافه شده به پروتئین نشان دهد. در مورد پروتئین ها نتایج معمولا به صورت مولار الیپتیسیتی Ellipticity)) بیان می شوند و با نماد  [θ]نشان داده می شود که از فرمول زیر قابل محاسبه می باشد:
در این فرمول الیپتیسیتی با θ ، مسیر نور عبوری بر حسب سانتی متر باl ، جرم مولکولی با M، غلظت پروتئین بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر با C، و تعداد رزیجوهای آمینواسید با n نشان داده شده است. درنهایت [θ]بر حسب deg.cm 2 .dmol -1 بدست می آید (124).
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون
2-9-6-1- دناتوراسیون
دناتوراسیون پروتئینی (شکل 29) می تواند یک فرآیند برگشت پذیر و یا غیر قابل برگشت باشد. دناتوراسیون در واقع به تغییری که در کنفورماسیون پروتئین ایجاد شود و منجر به آنفولد شدن کل ساختار پروتئین شود اطلاق می شود. علاوه براین، چنین تغییراتی بدون شکستن پیوندهای پپتیدی رخ می دهد. در این شرایط پروتئین بدلیل از دست دادن ساختار سوم خود فعالیت بیولوژیکی ندارد. از طرفی دناتوراسیون منجر به در معرض قرار گرفتن گروه های هیدروفوبیکی می شود که این امر تمایل جذب سطحی نقاط هیدروفوبیکی پروتئین ها را به یکدیگر و تشکیل و تجمع رسوب پروتئینی را افزایش می دهد (125).
شکل 29: دناتوراسیون پروتئینی.
2-9-6-2- مطالعه ی پایداری پروتئین ها
در تحقیقات بیومولکولی نظیر مهندسی پروتئین، شیمی پروتئین، کشف و طراحی داروها، تعیین فاکتورهای موثر در پایداری پروتئین ها اهمیت بالقوه ای دارد. در این تحقیقات از روی پارامترهایی نظیر تغییرات انرژی آزاد گیبس (°( ΔG و نیز ویژگی هایی که یک پروتئین در حین عبور از حالت طبیعی و فولد شده به حالت غیرطبیعی و آنفولد شده در حین دناتوراسیون پیدا می کند می توان پایداری ترمودینامیکی را مشخص کرد.
در بین پارامترهایی که پایداری یک پروتئین را تعیین می کنند، می توان به موارد زیر اشاره نمود از جمله به پیوندهای هیدروژنی، تعاملات هیدروفوبیک، پیوندهای واندروالسی، پل های نمکی و تعاملات آروماتیکی که همگی بستگی به نوع ترکیب آمینواسیدهای یک پروتئین دارند و نیز تغییرات پس از ترجمه نظیر گلیکوزیله شدن و متیله شدن که روی پروتئین ایجاد می شوند، همچنین یکسری فاکتورهای محیطی نظیر دما، فشار، نمک ها، PH وغیره هستند که روی پایداری یک پروتئین تاثیر می گذارند. به عنوان مثال اضافه نمودن یک ماده ی شیمیایی نظیر گوانیدین هیدروکلراید و یا اوره منجر به دناتوره شدن پروتئین و متعاقب آن تغییر در پایداری پروتئین می شود (127-126).
2-9-6-3- روش دناتوراسیون شیمیایی
اوره و گوانیدین هیدروکلراید ترکیباتی هستند که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند ( شکل30). این ترکیبات با تخریب پیوند های هیدروژنی منجر به آنفولد شدن پروتئین ها می شوند. در غلظت های بالا از این دناتوره کننده ها به عنوان مثال غلظت 8 مولار برای اوره وغلظت 4 مولار برای گوانیدین هیدروکلراید، پروتئین ها تمایل به آنفولد شدن دارند. در حقیقت دناتوراسیون شیمیایی منجر به از دست رفتن پایداری در پروتئین می شود. در حین دناتوراسیون شیمیایی ساختار اولیه پروتئین دست نخورده باقی می ماند. اما ساختارهای دوم وسوم پروتئین دستخوش تغییر می شوند. در این حالت پروتئین از حالت فولد شده به یکی از دوحالت نسبتا فولد شده و کاملا آنفولد شده می رسد. همچنین وجود مرحله ی حد واسط هم در این واکنش از طریق مطالعات دناتوراسیون شیمیایی قابل بررسی می باشد. فرآیند آنفولدینگ بعضی پروتئین ها در حضور گوانیدین هیدروکلراید سه حالت گذار را نشان می دهد، شامل مرحله ی (N) NATIVE، حد واسط (I) و مرحله ی آنفولد شده (U). وجود مرحله ی حدواسط در حین دناتوراسیون نشان دهنده ی پروتئین در حالت کره ی مذاب می باشد که دارای

فسفوریلاسیون تغییر بدهد که منجر به تغییرات در بیان ژنهایی می شود که حدواسط رشد سلول، تکثیر، تمایز، آپپتوز و تغییر شکل می باشند. مطالعات نشان داده است که برخی فلزات مانند نیکل، کادمیوم و … ، می توانند مسیرهای MAPK را فعال کنند(85-84).
شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن.
2-7-3- PI3K/Akt
مسیرهای فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز(PI3K)، در رشد سلول، تمایز و آپپتوز، نقش دارند. یک کیناز لیپیدی بوسیله تواناییهایش در فسفریله کردن فسفواینوزیتیدها (PIPs) در ناحیه 3´-OH حلقه اینوزیتول در غشای سلولی شناخته می شود. در فعال سازی توسط پروتئین تیروزین کینازهای گیرنده های فاکتور رشد، PI3K در غشاء سلول قرار می گیرد، جایی که PIPs را به منظور تولید پیامبر ثانویه فسفاتیدیل اینوزیتول 3,4,5- تری فسفات (PIP3) فسفریله می کند (شکل 17).
As, Cd, Co, Ni, and V نشان داده شده که می توانند باعث فعالیت مسیرهای PI3K/Akt بشوند (86).
شکل 17: مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز.
2-7-4- HIF
فاکتور رونویسی القاء شده 1 در شرایط هیپوکسی، نقش مهمی در هموستاز اکسیژن سلولی بازی می کند. در شرایط نرمال اکسیژن، به سختی قابل تشخیص است، اما به طور چشمگیری در شرایط هیپوکسی القاء می شود. در نتیجه فعالیت HIF-1، رونویسی از ژنهای مربوط به سرطان درگیر در رگزایی، بقای سلولی، حمل و نقل قند و سوخت و ساز بدن را تحریک می شود. به عنوان مثال باعث تنظیم فاکتور رشد اندوتلیال عروقی می شود که نقش مهمی را در تومور و رگزایی دارد (شکل 18).
کبالت و نیکل عوامل شناخته شده ای هستند که شرایط هیپوکسی را تقلید کرده در نتیجه باعث فعالیت HIF-1 می شوند. کادمیوم، کروم و آرسنیک هم گزارش شده که مسیر HIF-1 را فعال می کنند(88-87).
شکل 18: فاکتور رونویسی القاء شده 1.
2-7-5- NF-kB
در ابتدا به عنوان فاکتوری در هسته سلولهای B، به عنوان تقویت کننده زنجیره سبک کاپای ایمونوگلوبولین، سپس در تمام انواع سلولها یافت شد (شکل 19). در پاسخ به محرکهای التهابی، پروموتور تومور، سرطان زایی، پروتئین های ویروسی یا میتوژن، IkB، فسفوریله و یوبی کویینه شده، که منجر به تخریبش می شود. تخریب IkB، باعث آزاد شدن NF-kB جهت انتقال به هسته ها شده؛ جایی که رونویسی از ژن های ویژه ای را تنظیم می کند که حد واسط عملکردهای سلولهای مختلف هستند مانند: التهاب، ترانسفورماسیون، تکثیر، تهاجم، رگزایی، متاستاز و آپپتوز.
گرچه NF-kB، برای عملکرد نرمال سیستم ایمنی تنظیم می شود، اما عدم تنظیمش زمانی که NF-kB بیش از حد بیان می شود، در انواع سرطان ها نقش دارد. فلزات مانند: کادمیوم، نیکل، آرسنیک و …، بر عملکرد NF-kB، اثر می گذارند(89).
شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB.
2-7-6- NFAT
فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T (شکل 20)، پروتئین های جزء خانواده فاکتورهای رونویسی هستند که فعالیتشان بوسیله Ca و Ca/calmodulin-dependent serine phosphatase calcineurin کنترل می شود. NFAT نقش های زیادی را در خارج سیستم ایمنی بازی می کند که شامل: تمایز، رگزایی، غضروف زایی و چربی زایی می باشد. در زمان استراحت سلولی، پروتئین های NFAT، فسفریله هستند و در سیتوپلاسم قرار می گیرند. در تحریک، در طی افزایش کلسیم، بوسیله کلسینورین دفسفریله می شوند و به هسته انتقال می یابند. هنگامی که در هسته، پروتئین NFAT فعال شده و به سایت های DNA متصل می شود، کنترل رونویسی از ژنهای هدف در آن صورت می گیرد.
در قطع سیگنالینگ کلسیم، پروتئین NFAT، دوباره فسفریله شده و به سیتوپلاسم برمی گردد، در نتیجه فعالیتشان پایان می یابد. نشان داده شده است که نیکل، آهن و وانادیوم، NFAT، را فعال می کنند(91-90).
شکل 20: فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T.
2-7-7- AP
فعال کننده فاکتور رونویسی، پروتئین 1، (AP-1)، یک کمپلکس دایمر است که ازخانواده های JUN, FOS, ATF و MAF تشکیل شده است. فرم اصلی AP-1 در بسیاری از سلولها هترودایمر Fos/Jun است که تمایل بالایی برای اتصال به عامل حساس TPA (TRE)، دارد (شکل 21).
C-jun و C-fos، به عنوان تومورزا در نظر گرفته می شوند و با سرطان ها همراه هستند. تحریک خارج سلولی مانند سایتوکاین ها، اشعه UV، فاکتورهای رشد، ROS وسرطانزاها می توانند سبب القاء AP-1 شوند و سبب افزایش اتصال AP-1 به TRE ژنهای هدف، که در رشد سلول، پاسخ های التهابی و فرآیندهای بازسازی دخیل هستند. نشان داده شده است که کادمیوم، نیکل، کروم و …، می توانند AP-1 را فعال کنند(92).
شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1.
2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن
2-8-1- سرب
– سرب می تواند مانند یک پروموتر تومور در فیبروبلاستهای انسان عمل کند. اگرچه اثر سرب بر ROS نسبت به کادمیوم کمتر است، ولی همان می تواند سبب سمیت سلولی شود. پیشنهاد شده است که سرب در سطح سلولی و مولکولی ممکن است امکان ایجاد و یا افزایش عوامل سرطان زایی را بکند که در آسیب DNA و تنظیم پروموتر ژن ها، نقش دارد(94-93).
– مطالعات خاطر نشان کرده است که در معرض سرب قرار گرفتن، منجر به فسفوریلاسیون پروتئین tau در مغز رتهای آزمایشگاه شده است. طبق تحقیقات، قرار گرفتن در معرض سرب در اوایل زندگی می تواند جهت رشد شناختی مضر باشد که به IQ کمتر از حد انتظار در برخی از کودکان منجر می شود. همچنین هایپرفسفوریلاسیون پروتئین تائو در مغز منجر به اثرات مشابهی می شود که شاید همان نوع اختلال شناختی است (95).
– قبلا گزارش شده است که مواجهه با سرب هم در پیش سیناپس و هم در پس سیناپس، به دلیل مهار رسپتور N- متیل دی آسپارتات (NMDAR) باعث تغییرات در گسترش نورونها می شود.
NMDAR در طی سیناپس سازی بوسیله سرب مهار می شود که سیگنالینگ ترانس سیناپس پایین دست یعنی فاکتور نوروتروفیک مشتق شده از مغز (BDNF) را مختل می کند (شکل 22) و BDNF اگزوژن اضافی می تواند اثرات سرب را، هم در پروتئین بیانی پره سیناپتیک و هم در آزاد شدن حفره پره سیناپتیک بهبود ببخشد.
فعالیت NMDAR سایر مسیرهای سیگنالینگ ترانس- سیناپتیک ، مانند سیگنالینگ اکسید نیتریک (NO) را می تواند تنظیم کند. بنابراین، ممکن است که دیگر مسیرهای انتقال سیناپسی علاوه بر سیگنالینگ BDNF، توسط Pb+2 مختل شود.
BDNF-TrKB ، یک فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز است، یک نوروتروفین که عملکرد مهمی را در نورون و گسترش سیناپس دارد. سرب با ایجاد اختلال در سیگنالینگ BDNF-TrKB، باعث عدم تنظیم توسعه سیناپس و عملکرد صحیح می شود(96).
شکل 22: عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز.
– قرار گرفتن در معرض سرب از منابع زیست محیطی و صنعتی، به طور جدی در بهداشت عمومی نادیده گرفته شده است. توضیح اثر سرب بر روی عملکرد سلول استخوان، اساسی است برای فهمیدن خطرش که با بیماری های کم شدن توده استخوانی همراه است. این فرضیه که سرب، اثرات منفی بر توده استخوانی دارد آزمایش شده است. همچنین مکانیسم های زیر بنایی از سرب در مسیرهای سیگنالینگ استخوان، ارزیابی شده است(97).
– اثرات نوروتوکسیک ناشی از در معرض میزان کم سرب در محیط، مشکل قابل توجهی بویژه در بچه ها و نوزادان در تمام دنیا می باشد. مطالعات متعددی نشان داده است که سرب وقتی که غلظتش در خون بالا برود می تواند در مغز تجمع یابد. مکانیسم اثر سرب در مغز، هنوز به طور کامل مشخص نیست. سلولی که مسئول پاسخ گویی به تجمع و ذخیره سرب در سیستم عصبی مرکزی (CNS) است، استروگلیا می باشد.
ERK ½ (کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی ½)، عامل مهمی در شکل گیری پروسه تقویت یا پتانسیل طولانی مدت (LTP)می باشد. سرب با مختل کردن بیان ERK و سایر مولکول های سیگنال میتواند بر LTP اثر بگذارد. فاکتور رشد فیبروبلاستی پایه (bFGF)، یکی از فاکتورهای نوروتروفیک است که می تواند سلولهای نورون را در برابر تخریب سم، حفظ کند. به منظور بررسی اثر حفاظتی احتمالی bFGF روی استروگلیای اولیه کشت داده شده، مشاهده کردند که mRNA و بیان پروتئین ERK در استروگلیا، با bFGF درمان می شود. نتایج نشان داده است که bFGF اگزوژن می تواند از فعالیت ERK برعلیه تاثیر سرب حفاظت کند. بنابراین، bFGF بوسیله مسیر سیگنالینگ MEK1/ERK ممکن است یک فاکتور تنظیم کننده حمایتی و نوروتروفیک باشد (99-98).
2-8-2- کادمیوم
– علاوه بر اثرات مخرب وسیع بر سلامت انسان، فلزات سمی مانند کادمیوم می توانند باعث پیشرفت سرطان شوند. ویژگیهای سمی این فلزات تا حدودی به تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS)، مرتبط هستند که می توانند سبب تخریب DNA و سبب فرآیندهای اکسیداسیون احیای وابسته به فاکتورهای رونویسی شوند. (شکل 23). علاوه بر تخریب DNA، ROS می تواند سبب القاء چندین مسیر سیگنالینگ خارج سلولی بویژه NF-kB, JNK/SAPK/p38 و همچنین Erk/MAPK شود.
این مسیرهای سیگنالینگ می توانند منجر به القاء رونویسی از ژنهای هدفی شوند که می توانند سبب تکثیر یا تبدیل مقاومت آپوپتوز به سلول در معرض شوند. کادمیوم در معرض سلولها می تواند سبب تولید ROS، فعالیت MAPKs, NF-kB و AP-1 شود اما HIF-1 را سرکوب می کند(101-100).
شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ.
– کادمیوم می تواند پروتئین کینازهای سلولی (PKC) را فعال کند که منجر به افزایش فسفوریلاسیون فاکتورهای رونویسی مختلف شده و در عوض منجر به فعالیت بیان ژن هدف شود. مکانیسم های سمیت کادمیوم هنوز به خوبی مشخص نشده است، اما مشخص است که به صورت خارج سلولی بویژه از طریق رادیکال آزاد مخرب، به ویژه در ریه ها، کلیه ها، استخوان، سیستم عصبی مرکزی، اندامهای تناسلی و قلب عمل می کند(102).
– MAPKs(i.e., ERK, JNK, & p38)، وقتی در معرض کادمیوم قرار می گیرند با حساسیت های مختلف فعال می شوند. اینکه مسیرهای سیگنالینگ در مواجه با فلزات سنگین یا منجر به حفاظت سلولها می شوند یا مرگ سلولی، هنوز کاملا شناخته نشده است. پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژن (MAPKs)، مانند پروتئین کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی (ERK)، c-Jun, JNK و p38، سبب انتقال سیگنالهای خارج سلولی به هسته می شود و نشان داده شده است که برای شرکت در زمینه های گوناگون از اعمال سلولی مانند رشد سلول، تمایز و آپوپتوز نقش دارند (شکل 24).
مواجهه با کادمیوم، می تواند ERK, JNK و p38 MAPK را فعال کند و سبب القاء بیان ژنهای c-fos و c-jun اولیه جهت گسترش آپپتوز شود. با این حال به نظر می رسد که اعضای خانواده MAPK به طور متفاوت؛ بسته به فلز سنگین و نوع سلول در معرض، فعال می شوند. در نتیجه، پاسخ های سلولی مختلف ممکن است توسط الگوی مشخص از فعالیت MAPKs، ایجاد شود. MAPKs ممکن است یکی از مسیرهای مهم انتقال سیگنال سلولی باشد که تحت تاثیر آلودگی های زیست محیطی، از جمله فلزات سنگین، قرار می گیرد (103).
شکل 23: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK.
– اثرات شبه استروژن کادمیوم و افزایش خطر سرطانهای وابسته به هورمون ناشی از در معرض کادمیوم قرار گرفتن در چندین مطالعه گزارش شده است. کادمیوم بر روی مسیرهای سیگنالینگ سلولی بویژه بر روی سیگنالینگ استروژن موثر است. Cd به طور قابل توجه ای بر فسفوریلاسیون کیناز و بیان ژن اثر می گذارد و فسفوریلاسیون ERK1/2 را به طور قابل توجه ای افزایش می دهد (104).
– ساختارهای zinc-finger که در فاکتورهای رونویسی و پروتئین های ترمیم DNA یافت می شوند، واسطه های اتصال protein-protein و DNA-proteinمیباشند. در غلظت های پائین این فلزات(Cd,Ni,Co,Ars) مداخله در رونویسی DNA و ترمیم دیده شده است. واکنش یونهای فلزات سمی

مثال از پروتئین گذرنده از غشا، Sefمی باشد که با الگوی مشابه به FGF8 در موش بیان می شود. دو مکانیسم تنظیمی متفاوت برای این مولکول مطرح شده است که یکی این است که احتمالا Sef از طریق برهم کنشی که با FGFR1، FRS2 و مسیرMAP کیناز و Aktمی دهد قادر است مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی را مهار کند و دیگر اینکه ممکن است روی مسیر پایین دست MEK اثر بگذارد. در واقع اثر مهاری Sef روی فعالیت ترانس لوکیشن هسته ای ERK، بدون مهار فعالیت سیتوپلاسمی آن می باشد (52).
مثال دیگر از پروتئین های تنظیمی درسطح تنظیمی گذرنده از غشاء XFLRT3 است که در زنوپوس شناسایی گردیده است. این پروتئین تنظیم گر مثبت مسیر پیام رسانی FGF می باشد. همچنین مولکول های چسبندگی سلولی یا CAMs با ناحیه ی خارج سلولی خود مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی را از طریق مسیر PLCγ/Ca2+ تنظیم می کنند. این فعل و انفعالات به خوبی در مورد سلول های عصبی مطالعه گردیده است (53).
سطح تنظیمی بعدی در سطوح داخل سلولی مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی توسط دو گروه از پروتئین ها صورت می گیرد. در گروه اول PTP ها جای می گیرند که به طور کلی تنظیم کننده های مثبت و منفی پیام رسانی RTK می باشد. گروه دوم SPROUTY پروتئین ها می باشند که در دروزوفیلا شناسایی شده اند. بعدها چهار عضو دیگر از این خانواده در پستانداران شناسایی گردید. تمامی اعضای پروتئین های خانواده ی SPROUTY نواحی حفاظت شده ی غنی از سیستئین در انتهای C-ترمینال خود دارند که به ترانس لوکشین آنها به غشای پلاسمایی و عمل به عنوان یک تنظیم گر منفی کمک می کند. پروتئین های Sprouty در واقع به عنوان مولکول تنظیمی منفی در مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی عمل می کند (54).
2-2- فلز چیست؟
فلز ماده‌ای است که می‌توان آن را صیقل داده و براق کرد ( بجز جیوه که در دمای اتاق به شکل مایع است) یا به طرح‌های گوناگون درآورد و از آن مفتول‌های سیمی ظریف تهیه کرد(56-55).
2-2-1- فلزات سمی
فلزات سنگین که سرب، آلومینیوم، جیوه، مس، کادمیوم، نیکل و آرسنیک را شامل می گردد از سموم پرخطر پیرامون ما می باشند. این سموم در هوای تنفسی، آب آشامیدنی، مصالح ساختمانی، لوازم آشپزخانه و حتی البسه موجود می باشند. برخی فلزات به مقدار ناچیز برای عملکرد طبیعی بدن ضروری هستند، اما ورود بیش از اندازه آن ها به بدن مسمومیت ایجاد خواهد کرد .ایراد اصلی فلزات سنگین این است که در بدن متابولیزه نمی گردند. در واقع فلزات سنگین پس از ورود به بدن دیگر از بدن دفع نشده و در بافت های بدن انباشته می گردند و همین امر موجب بروز بیماری ها و عوارض متعددی در بدن می شود.
فلزات سمی، فلزاتی هستند که به صورت ترکیبات محلول، سمی هستند و نقش بیولوژیکی ندارند و مواد معدنی ضروری نیستند. اغلب تصور می شود که فلزات سنگین هم خانواده آنها هستند اما برخی فلزات سبک هم سمی هستند، مانند برلیوم. همچنین همه فلزات سنگین سمی نیستند، بلکه برخی از آنها مانند آهن ضروری می باشند. گاهی این فلزات سمی از عمل یک عنصر ضروری در بدن تقلید می کنند که باعث تداخل در پروسه متابولیک (سوخت و ساز) شده و در نتیجه منجر به بیماری می شوند، از جمله آن، تداخل درعمل سیگنالینگ است.
سمیت یک عملکرد محلول است، ترکیبات نامحلول، همچنین اشکال فلزی، اغلب سمیت ناچیزی را نشان می دهند. موجودات زنده به میزانهای مختلف به فلزات نیاز دارند. میزان زیاد آنها می تواند مخرب بوده و منجر به تخریب یا کاهش عملکرد ذهنی و اعصاب مرکزی شوند. برخی اثرات شامل: اثر روی سیستم عصبی توسط سرب، اثر روی کلیه و کبد توسط سرب و کادمیوم، اثر بر روی پوست و استخوان توسط نیکل و کادمیوم است. اختلالات عصبی (پارکینسون، آلزایمر، افسردگی و اسکیزوفرنی)، انواع سرطان ها، سقط جنین، اختلالات تنفسی و قلبی-عروقی، ناباروری، تضعیف سیستم ایمنی بدن، دیستروفی عضلانی و مولتیپل اسکلروز، تخریب ژن ها و مرگ از جمله مضرات فلزات سمی می باشد.(59-57).
2-2-3- سرب
سرب از عنصرهای شیمیایی واسطه در جدول تناوبی است. سرب عنصر شیمیایی است که در جدول تناوبی با نشان Pb و عدد اتمی ۸۲ وجود دارد. موارد استفاده معمولی سرب به شرح زیر است: در باطریهای اسید سرب، در اجزای الکترونیکی، در باطری خودرو، سرامیک ها، خاکستر سیگار، دود اگزوز خودروها، بنزین سرب دار و غیره. سرب فلز سمی است که به پیوندهای عصبی آسیب رسانده (بخصوص در بچه‌ها) و موجب بیماریهای خونی و مغزی می‌شود. تماس طولانی با این فلز یا نمکهای آن، مخصوصاً نمکهای محلول یا اکسید غلیظ آن PbO2 می‌تواند باعث بیماریهای کلیه و دردهای شکمی شود. حدود 7% سربی که انسان از طریق غذا دریافت می کند توسط گوشت است. طبق توصیهWHO دریافت سرب توسط انسان نباید در هفته بیش از 3 میلی گرم باشد، یعنی 400 میکروگرم در روز. حالت مسمومیت زمانی ایجاد می شود که میزان سرب بین 6/0 تا 1 میکروگرم در خون باشد و کودکان چون 6 برابر بزرگسالان قدرت جذب سرب از طریق غذا را دارند در معرض خطر بیشتری هستند. سرب معمولاً با توجه به ترکیب غذا و وضعیت فیزیولوژیک دستگاه گوارش در بزرگسالان به میزان 5 تا 10% و در کودکان تا 50% توسط روده ها جذب می شود. میزان جذب سرب از طریق دستگاه تنفسی بالاتر بوده و بین 30 تا 50% می باشد (64-60).
2-2-4-کادمیوم
کادمیوم، عنصر شیمیایی است که در جدول تناوبی با نشان Cd و عدد اتمی ۴۸ قرارگرفته ‌است. کادمیوم در آلیاژهای دندانی، باطری ها، روغن موتور، غذاهای دریایی، سرامیک ها، دود سیگار، چای و قهوه، کودها و غیره وجود دارد. کادمیوم از معدود عناصری است که هیچگونه نقش ساختاری در بدن انسان ندارد. این عنصر و محلول ترکیبات آن حتی به میزان بسیار کم، سمی هستند و در اندام‌ها و محیط زیست ذخیره می‌شوند. استنشاق گرد کادمیوم به سرعت در دستگاه تنفسی و کلیه‌ها ایجاد مشکلاتی می‌کند که می‌تواند کشنده باشد (اغلب از نارسائی کلیوی). خوردن هر مقدار قابل ملاحظه‌ای از کادمیوم موجب مسمومیت سریع کبد وکلیه‌ها می‌گردد. ترکیباتی که محتوی کادمیوم هستند نیز باعث مسمومیت می‌شوند (69-65).
2-2-5- نیکل
نیکل عنصری است فلزی با عدد اتمی ۲۸، نماد علمی Ni که در گروه VII و در دوره چهارم جدول تناوبی جای دارد. نیکل در بیکینگ پودرها، پروتزهای دندانی، دود اگزوز خودروها، پسماندهای صنعتی، غذاهای فرآوری شده، کودها، روغن های هیدروژنه، ظروف استنلس استیل موجود می باشد. مقدار اندک نیکل برای انسان ضروری است اما اگر مقدار آن افزایش یابد، برای سلامت انسان خطرناک است و شانس مبتلا شدن به سرطان ریه، سرطان بینی، سرطان حنجره و سرطان پروستات را افزایش می دهد. آب آوردن ریه ها، مشکلات تنفسی، کاهش توانایی تولید مثل، آسم و برونشیت مزمن، حساسیتهایی از قبیل خارش پوست (به خصوص در هنگام استفاده از جواهرات) از مضرات آن می باشد. از لحاظ تقسیم بندی برنامه سم شناسی ملی آمریکا (NTP)، نیکل و ترکیبات آن جز عوامل سرطانزا محسوب می شوند و از نظر طبقه بندی آژانس بین المللی تحقیقات سرطان (IARC) ترکیبات نیکل در گروه یک قرار می گیرند (75-70).
2-2-6-آلومینیوم
آلومینیوم عنصری شیمیایی در گروه بورون با عدد اتمی ۱۳ و نماد Al است. آلومینیوم در ظروف آلومینیومی، فویل، قوطی ها، برخی داروها (مانند ضد اسید معده)، سرامیک ها، فیلتر سیگار، مصالح ساختمانی ،آمالگام دندان، دئودرنت ها، آفت کش ها، نمک خوراکی، دود سیگار، بیکینگ پودر، خمیر دندان نیز موجود می باشد. آلومینیوم یکی از معدود عناصر فراوانی است که ظاهراً هیچ فعالیت موثری در سلولهای زنده ندارد. در انسان آلومینیوم مانند فلزات سنگین، سمی نیست، اما در صورت مصرف زیاد علائمی از مسمومیت دیده شده ‌است. بعلاوه احتمال ارتباط آلومینیوم با بیماری آلزایمر مطرح شده‌ است. مصرف زیاد این عنصر باعث کم خونی نیز می‌گردد. بیماری های ناشی از مصرف زیاد آلومینیوم شامل: آلزایمر، پارکینسون، آرتریت روماتوئید، بیماریهای استخوانی، اختلالات خودایمنی، آلرژیها، صرع، یبوست، مشکلات قلبی، بیش فعالی، بیماری های کلیوی، پوکی استخوان و اسکیزوفرنی که با مصرف زیاد آلومینیوم در ارتباط است .گاهی این فلزات سمی از عمل یک عنصر ضروری در بدن تقلید می کنند که باعث تداخل در پروسه متابولیک (سوخت و ساز) شده و در نتیجه منجر به بیماری می شوند، از جمله، تداخل درعمل سیگنالینگ است(79-76).
2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ
مطالعات اخیر نشان داده است که فعالیت انواع مسیرهای سیگنالینگ که در مواجه با فلزات ایجاد می شود، می تواند بر بیان ژنهای متعددی که نقشهای مهمی را در سرطانزایی به عهده دارند، اثر بگذارد. فلزات باعث تولید مسیرهای سیگنالینگ می شوند که به طور عمده شامل مسیرهای: ROS, MAPKs, PI3K, HIF-1, NF-kB, NFAT و AP-1 می باشد(82-80).
2-7-1-ROS
گونه های اکسیژن فعال (ROS)، مولکول های بسیار واکنش پذیر با الکترونهای جفت نشده در طی متابولیسم اکسیداتیو می باشند. آنها شامل آنیون سوپر اکسید (O2-)، رادیکال هیدروکسیل (OH) و پراکسید هیدروژن (H2O2) هستند که به طور مداوم در سیستم های بیولوژیکی تولید و حذف می شوند و نقش مهمی در تنظیم تکثیر سلولی، آپوپتوز، تحول و پیری به عهده دارند.
سلول ها با آنتی اکسیدانهای پاک کننده قادر به دفاع در برابر این استرس هستند مانند: آسکوربات، گلوتاتیون و تیوردوکسین و آنزیم های آنتی اکسیدان مانند: سوپراکسیددسموتاز [SOD]، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و تیوردوکسین ردوکتاز. با این سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی، سلول ها می توانند با غلظت های فیزیولوژیکی کم از ROS ، انطباق یابند. با این حال، ROS می تواند سبب آسیب اکسیداتیو ماکرومولکولهای سلولی شود، از جمله DNA، پروتئین ها، و چربی ها. وقتی میزان آن افزایش می یابد، سبب افزایش دفاع های آنتی اکسیدان می شود.
ROS نقش مهمی را در شروع آسیب سلولی دارد که می تواند منجر به ایجاد سرطان شود. یکی از مهمترین راههایی که ROS باعث سرطان می شود، عمل کردن به عنوان پیامبرهای انتقال سلولی است که سبب فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ از جملهMAPK, PI3K, NF-kB و NFAT می شود (شکل 15). بنابراین ما ROS را در بحث اثرات ترکیبات فلزی در مسیرهای سیگنالینگ در نظر می گیریم. مطالعات نشان داده است که سلولهای در معرض Pb, Cd, Ni, As, Coو Cu ، همچنین بسیاری از ترکیبات فلزی دیگر، می توانند سبب تولید ROS اضافی در سلولها شوند(83-81).
شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS.
2-7-2- MAPK
پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن (MAPK) مسیر سیگنالینگ، نقش مهمی را در کنترل برنامه های بیان ژن در پاسخ به سیگنال های خارج سلولی در سلول های یوکاریوتی دارد. چهار گروه اصلی از خانواده MAPK در سلولهای پستانداران وجود دارد که آنها سرین/ تره اونین کینازها هستند: کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی (ERK)، کیناز N- ترمینال c-jun (JNK)، p38 و کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی شماره 5 (ERK5) / MAPK-1 بزرگ (BMK1). هر گروه همچنین شامل تعدادی ایزوفرم هستند. مسیرهای سیگنالینگ اصلی MAPK، یک سری آبشار فسفوریلاسیون است (شکل 16).
جهت دریافت سیگنالهای خارج سلولی مانند فاکتورهای رشد، هورمون ها و محرک های استرس، MAPKs بوسیله فسفوریلاسیون تره اونین و تیروزین با کینازهای MAPK (MAPKK) فعالیت می کنند، که بوسیله فسفوریلاسیون سرین/ تره اونین با کینازهای کیناز MAPK فعال می شوند (MAPKKK). با فعال شدن، MAPKs می تواند فعالیت فاکتورهای رونویسی و تنظیم کننده های رونویسی را بوسیله