فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کیناز (RTK) هستند و همه آن‏ها یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی با خاصیت تیروزین کینازی دارند. قسمت خارج سلولی یک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی اولیه شامل سه ناحیه (Domain) شبه ایمونوگلوبولین (Ig) ،(D1، D2 و D3) است که توسط اتصال‏دهنده های انعطاف‏پذیر به یکدیگر متصل شده‏اند. از ویژگی‏های منحصر به فرد گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی وجود توالی‏ غنی از گلوتامات، آسپارتات، سرین درناحیه‏ی اتصال D2-D1 است که جعبه AB1 نامیده می‏شوند. موقعیت رزیجوهای تیروزین، جعبه اسیدی و هم چنین نواحی شبه ایمونوگلوبولین گیرنده در شکل 9 نشان داه شده است (23-21). هم چنین دو مکان اتصال برای فاکتور رشد فیبروبلاست، یک مکان اتصال به هپارین، و یک سایت تعامل گیرنده–گیرنده در D2 و D3 این گیرنده‏ها شناسایی شده است. اتصال مولکول‏های فاکتور رشد فیبروبلاست به گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی باعث جفت شدن (دایمریزیشن) گیرنده و به دنبال آن ترانس فسفریلیشن تیروزین موجود در حلقه‏ی فعال‏سازی ناحیه کینازی می‏شود. متعاقب آن قسمت انتهای کربوکسیل (COOH-terminal tail) گیرنده فسفریله می‏شود. در نتیجه گیرنده فعال شده و پروتئین‏های داخل سلولی مثل FRS2 (FGFR substrate2) را نیز فسفریله و فعال می کند. در نهایت شبکه‏ی انتقال پیام (سیگنالینگ) داخل سلولی القاء می‏شود که فرآیندهای بیولوژیکی کلیدی مانند تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز را به طور دقیق تنظیم می‏کنند (25-23).
در مجموع هفت گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی اصلی شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 داخل سلول وجود دارد. ایزوفرم b معمولاً در بافت اپی‏تلیال بیان می‏شود در حالی که ایزوفرم c معمولا در بافت مزانشیمی بیان می‏شود. لیگاندها در هر دو بافت اپی‏تلیال و مزانشیمی تولید می‏شوند و به طور کلی گیرنده‏های بافت مخالف خاص خود را فعال می‏کنند. در شرایط فیزیولوژیکی طبیعی یک لیگاند تولید شده در اپی‏تلیوم، گیرنده مزانشیمی را فعال می‏کند و برعکس. در وضعیت‏های پاتولوژیک این اتصال اختصاصی لیگاند و گیرنده از بین می‏رود که این امر در سرطان‏هایی شایع است که بیان بیش از اندازه‏ی پروتئین‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی در آن‏ها مشاهده می‏شود (27-26).
شکل9: گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن. موقعیت ریشه های تیروزین روی بخش داخل سلولی گیرنده نشان داده شده است. نواحی شبه ایمونوگلوبولین D1, D2, D3 در قسمت خارج سلولی گیرنده و ناحیه جعبه اسیدی در شکل نشان داده شده است.
2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی
عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینگ) گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط است، مانند سندرم‏های اسکلتی از جمله سندرم کروزون و سندرم فایفر که به دلیل جهش در ناحیه کینازی پروتئین FGFR2 ایجاد می‏شوند (28)، سندرم کالمن که می‏توان آن را به جهش در FGFR1 نسبت داد (29). سندرم LADDکه به دلیل کاهش عملکرد ناحیه کینازی FGFR2 و FGFR3 ایجاد می‏شود (30) و نیز برخی از سرطان‏ها. در سرطان‏های انسانی پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی توسط مکانیسم‏های مختلف نامنظم می‏شوند از جمله بیان نابجا، جهش، امپلیفیکیشن و بازآرایی‏های کروموزومی. چندین تغییر ژنتیکی و جهش درون خانواده‏ی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی شناسایی شده‏اند. تغییرات ژنتیکی که فنوتیپ سرطانی را ایجاد می‏کنند شامل جهش حذفی، جهش افزایش عملکرد، جهش ازدست دادن عملکرد و امپلیفیکیشن است (31). فرم‏های جهش یافته‏ی پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی در سرطان‏های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است (33-32). جهش‏های افزایش عملکرد در پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی مسئول بیماری‏های مختلف از جمله کرانیوستوزیس ، سندرم کوتولگی و برخی از سرطان‏ها است. اغلب جهش‏ها در پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی مستقل از لیگاند هستند اما در بعضی موارد مانند Ser252Trp و Pro253Arg در اکتودومین مولکول FGFR2 تنها در هنگام اتصال لیگاند اثرشان ظاهر می‏شود. این جهش‏ها باعث سندرم آپرت از طریق افزایش تمایل اتصال لیگاند و از طرفی بالا رفتن میزان اتصال نامناسب لیگاندها به گیرنده‏های خود می‏شود (34). جهش‏های ناحیه ی گذرنده از غشا، مانند Gly380Arg در FGFR3، اینتراکشن غیرکوالانسی بین هلیکس های گذرنده از غشا را زیاد می‏کند و تقریباً در همه‏ی موارد آکنودروپلازیا که شایع‏ترین فرم ژنتیکی کوتولگی است دیده می‏شود (35). جهش‏هایی که منجر به بیان بیش از اندازه و افزایش عملکرد FGFR3می‏شوند در مولتیپل میلوما که یک بدخیمی غیرقابل درمان سلول‏های B است رخ می‏دهد (36).FGFR4 ارزش بالقوه‏ای به عنوان یک مارکر پیش‏آگهی در سرطان دارد. Arg388 در FGFR4 با افزایش پیش‏روی سرطان پروستات مرتبط است، این پروتئین با افزایش تحرک و تهاجم سلولی موجب افزایش متاستاز می‏شود(37). برخی از این بیماریها و جهش ها ی نقطه ای به همراه اختلالات پاتولوژیکی مربوطه در شکل 10 نشان داده شده اند.
الف)
ب)
ج)
شکل10: برخی از بیماری ها (الف و ب) و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی(ج). این جهش ها در نواحی مختلف خارج سلولی، ناحیه گذرنده از غشا و ناحیه کینازی گیرنده های FGFR1,2,3 به همراه اختلال پاتولوژیکی مرتبط با جهش مورد نظر با علامت فلش در شکل مشخص شده اند.
2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی
با اتصال فاکتورهای رشد فیبروبلاستی به گیرنده های آنها، مسیر پیام رسانی FGF آغاز می شود. هپارین موجود در ماتریکس خارج سلولی و یا پروتئوگلیکان هایی که در سطح سلول حضور دارند این اتصال را تسهیل می کنند. به دنبال این اتصال دایمریزیشن گیرنده رخ می دهد و متعاقب آن تیروزین های موجود در خود گیرنده توسط ناحیه ی کینازی آن فسفریله می شوند، این فرآیند اتوفسفریلیشن نامیده میشود. همچنین فسفریله شدن ناحیه داخل سلولی محل مناسبی را برای اتصال مولکول های پایین دست گیرنده نظیر فسفولیپاز Cγ و نیز Src کینازها فراهم می کند. مولکول دیگری که فسفریله و فعال میشود، سوبسترای دوم گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی یا (FRS2) می باشد (شکل11). از طریق این مولکول ها سه مسیر متفاوت زیر فعال می گردند (38).
شکل11: مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی. فسفولیپاز Cγ و سوبسترای دوم گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی یا (FRS2) به عنوان دو مولکول هدف داخل سلولی اصلی برای این گیرنده ها در شکل نشان داده شده است. با اتصال فاکتورهای رشد فیبروبلاستی به گیرنده های آن، مسیر پیام رسانی FGF آغاز می شود. به دنبال این اتصال دایمریزیشن و متعاقب آن اتوفسفریلیشن گیرنده رخ می دهد، سپس با اتصال مولکول های پایین دست گیرنده فسفولیپاز Cγ، نظیر Src کینازها و (FRS2) پیام داخل سلولی ایجاد می شود.
2-1-6-1- مسیر Ras/MAP Kinase
یکی از مولکولهای مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاست، داکینگ مولکول FRS2 می باشد (39). نقش این مولکول کنار هم قرار دادن پروتئین ها برای هر دو مسیر MAP کیناز و PI3 کیناز می باشد (40). پس از فعال شدن گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاست، ناحیه تیروزین کیناز این گیرنده، ریشه ی تیروزین موجود در FRS2 را فسفریله می کند. این مراحل محلی مناسب برای اتصال مولکول های آداپتور نظیر (GRB2) فراهم می کند. خود مولکول (GRB2) شامل نواحی (SH3) یا (PTP) می باشد (41). هم چنین مولکول (SOS) از طریق ناحیه ی (SH3) به مولکول (GRB2) متصل می شود. مولکول SOS یک فاکتور تبادل نوکلئوتید گوانین است که پس از تشکیل کمپلکس با GRB2 قادر است مولکول Ras را فعال کند. فعال شدن Ras توسط SOS با تعویض GDP با GTP صورت می پذیرد. با فعال شدن Ras این مولکول قادر است با افکتور پروتئین هایی نظیر Raf برهم کنش دهد و بدین ترتیب آبشار مسیر پیام رسانی MAP کیناز فعال می گردد. این مسیر درچرخه سلولی نقش دارد و فعالیت های بیولوژیکی نظیر بقا، مهاجرت، تکثیر و مرگ سلولی را موجب می شود (43-42)(شکل 12).
شکل 12: مسیر پیام رسانی .Ras/MAP Kinase
2-1-6-2- مسیر PLCγ/Ca2+
پس از فسفریله شدن ناحیه داخل سلولی گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی، مولکول فسفولیپاز Cγ به تیروزین فسفریله شده ریشه ی 766 در FGFR1متصل می گردد و توسط ناحیه ی تیروزین کینازی گیرنده فسفریله می شود (44). در واقع نقش مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی در فعال شدن مسیر PLCγ/Ca2+ از طریق ایجاد جهش های خاص در گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی مشخص گردیده است. زمانی که PLCγ فعال می شود قادر است فسفاتیدیل اینوزیتول 4و5 دی فسفات را به دو مولکول دی آسیل گلیسرول (DAG) و نیز اینوزیتول 1و4و5 تری فسفات (IP3) هیدرولیز کند. هردو این مولکول های پیام رسان ثانویه در تنظیم غلظت کلسیم داخل سلولی نقش دارند. مولکول DAG پروتئین کیناز C را فعال می کند و IP3 تنظیم کلسیم داخل سلولی را بر عهده دارد (45) (شکل 13).
شکل 13: مسیر پیام رسانی PLCγ/Ca2+.
2-1-6-3- مسیر PI3 Kinase/Akt
این مسیر از طریق سه مکانیسمی که در مسیر پایین دست گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی قرار دارند فعال می شود. این مسیر یا میتواند به طور مستقیم توسط گیرنده و یا به طور غیر مستقیم از طریق Gab1 و یا Rasفعال گردد. هم چنین Akt یا پروتئین کیناز Bتوسط PI3 کیناز فعال می شود. در اغلب موارد در مراحل رشد و توسعه سلولی دو مسیر PI3 kinase/ Akt و Ras/MAP کیناز به موازات یکدیگر عمل میکنند (46) (شکل 14).
شکل 14: مسیر پیام رسانی PI3 Kinase/Akt.
2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی
مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی توسط یکسری سیگنال های مثبت و منفی تنظیم می شود. بسیاری از این سیگنال های تنظیمی بین تمام گیرنده های تیروزین کیناز مشترک است و بسیاری نیز خاص مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی است (47). همچنین فاکتور رشد فیبروبلاستی بیان بعضی از مولکول های تنظیمی خود را تحت کنترل دارد، درنتیجه بسیاری از آن ها به طور هم زمان با فاکتور رشد فیبروبلاستی بیان می شوند (48).
این تنظیمات در سطوح مختلف سلولی نظیر سطح خارج سلولی، سطح گذرنده از غشاء و سطح داخل سلولی رخ می دهد. در سطح خارج سلولی هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها نقش مهمی را در تنظیم تعامل بین فاکتور رشد فیبروبلاستی و گیرنده بازی می کنند. هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها عبارتند از گلیکوزآمینوگلیکان های سولفاته که به طور کووالانسی به پروتئین اصلی متصل شده اند و یک ساختار بسیار متنوع را بر مبنای توالی گلیکوزآمینوگلیکان های خود تشکیل می دهند (49). به منظور شکل گیری مطلوب تر این ساختار از تعامل بین فاکتور رشد فیبروبلاستی وگیرنده، لازم است که ترانسفرازهایی نظیر گلیکوزیل ترانسفراز و نیز سولفوترانسفراز قندی تغییراتی از نظر موقعیت فضایی و زمانی در هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها ایجاد کنند (50). همچنین این مولکول ها قادرند از دناتوراسیون حرارتی فاکتور رشد فیبروبلاستی، پروتئولیز و نیز جلوگیری از انتشار آن ها به فضاهای میان بافتی محافظت کنند (51). درسطح تنظیمی بعدی یعنی سطح گذرنده از غشاء، پروتئین های تنظیمی زیادی تشخیص داده نشده اند. یک

ه یکدیگر متصل می‌شوند تا یک پلی پپتید را به وجود بیاورند.
اسیدهای آمینه در شکل پروتئین خود فعالیتهای زیستی بی شماری از نظر ساختمانی، هورمونی و کاتالیزوری دارند. اسیدهای آمینه دارای یک گروه بازی ازته، که عموماً یک گروه آمینی (-NH2) است و یک واحد کربوکسیل اسیدی (COOH)، می باشند (شکل 4).
شکل 4: ساختمان اصلی یک اسید آمینه.
2-1-1- ساختمان پروتئین ها
پروتئین ها در واکنش های بدن و ساختمان آن نقش عمده دارند و نوع فعالیت آنها به ساختمان آنها بستگی دارد. بر اساس توالی اسیدآمینه، نوع، تعداد و چگونگی آرایش فضایی حاصل، پروتئین ها دارای 4 ساختمان اولیه، ساختمان نوع دوم، نوع سوم و نوع چهارم هستند.
2-1-1- 1- ساختمان اولیه
ساختمان اول پروتئین ها در ارتباط با ترتیب اسیدهای آمینه در زنجیره پلی پپتیدی است. با دانستن تعداد اسیدهای آمینه، نوع و توالی قرار گرفتن آنها ساختمان نوع اول مشخص می شود.
ساختمان اول توالی اسیدهای آمینه یا به عبارت دیگر آرایش اسیدهای آمینه در یک زنجیره پلی‌پپتید خطی است (شکل 5). دو پروتئین مختلف که تشابه معنی‌داری در ساختمان اول داشته باشد گفته می‌شود که با یکدیگر همولوگ هستند و بنابراین توالی DNA آنها نیز مشابه است. باور عمومی بر این است که دو پروتئین همولوگ از نظر تکاملی نیز بهم مرتبط هستند و از یک ژن اجدادی مشترک تکامل یافته‌اند.
2-1-1-2- ساختمان نوع دوم
ساختمان دوم بطور عمده از رشته های بتا و مارپیچ آلفا ساخته شده است (شکل 5). تشکیل ساختمان دوم در یک منطقه محلی از زنجیره پلی‌پپتیدی تا حدی بوسیله ساختمان اول تعیین می‌شود. توالیهای آمینواسیدی خاصی برای رشته‌های بتا یا مارپیچ آلفا مناسب است و بقیه برای تشکیل مناطق حلقه مناسب هستند. عناصر ساختمان دوم معمولاً خودشان را در شکل موتیف‌های ساده آرایش می‌دهند. موتیف‌ها بوسیله چفت شدن زنجیره‌های جانبی مارپیچ‌های آلفا یا رشته های بتای مجاور و نزدیک بهم تشکیل می‌شوند. معمولاً چندین موتیف برای تشکیل ساختارهای فشرده کروی ترکیب می‌شوند که دومِین نامیده می‌شوند.
ساختمان نوع دوم پروتئینها به ساختار زنجیره اسیدهای آمینه ای اطلاق می گردد که حاصل ایجاد پیوند
هیدروژن بین گروههای ایمینو و کربونیل اسیدهای آمینه مجاور می باشند.
1- منظم باشد زنجیره پلی پپتیدی مارپیچ α و صفحه β
2- یک کلاف گرد نامنظم باشند.
دلیل بروز چنین مارپیچ α ، وجود پیوندهای هیدروژنی است.
2-1-1- 2-1- مارپیچ آلفا
در صورتی که پیوندهای هیدروژنی در یک زنجیره پلی پپتیدی ایجاد شوند، پیوند بسیار پایداری حاصل می شود. صفحات اصلی یک زنجیره پپتیدی دور یک محور فرضی چرخش یافته و یک فرم مارپیچ را به ساختار فضایی می دهد.
 مارپیچ آلفا یک مارپیچ راست‌گرد است که ساختار آن هر ۴/۵ آنگستروم یک‌بار تکرار می‌شود. در هر دو مارپیچ آلفا، ۶/۳ اسید آمینه وجود دارد. یعنی هر ۵/۱ آنگستروم یک اسید آمینه در طول مارپیچ آلفا قرار می‌گیرد. هر گروه کربوکسیل و آمین در مارپیچ آلفا با اسید آمینه‌ای با فاصله چهار تا از خود، دارای باند هیدروژنی می‌باشد و این الگو در سراسر مارپیچ، غیر از چهار اسیدآمینه در دو انتهای آن تکرار شده‌ است.
مارپیچ آلفا از عناصر کلاسیک ساختمان پروتئین است که اولین بار در سال 1951 توسط پائولینگ توصیف شد. او پیشگویی کرد که این ساختمان باید پایدار و از نظر انرژتیک در پروتئین مناسب باشد.
مارپیچ آلفا در پروتئین وقتی پیدا می شود که در یک قطعه از توالی، همگی زوایای φ و ψ تقریباً 60- و 50- داشته باشند. همه پیوند های هیدروژنی در یک مارپیچ آلفا در یک جهت هستند، به دلیل آنکه واحد های پپتیدی در یک جهت در طول محور مارپیچ دنبال هم قرار گرفته اند.
اثر کلی یک دو قطبی خالص برای مارپیچ های آلفا این است که یک بار مثبت جزئی درانتهای آمینو و بار منفی جزئی در انتهای کربوکسی مارپیچ آلفا دارد. این بار برای جذب لیگاند های با بار مخالف و لیگاندهای با بار منفی بویژه آنهاییکه دارای گروه فسفات هستند و معمولاُ به انتهای نیتروژن مارپیچ آلفا وصل می شوند اثر دارد.
دیده شده است که زنجیره های جانبی مختلف تمایل ضعیف اما معینی برای حضور در مارپیچ آلفا یا عدم حضور در آن دارند. بنابراین آلانین، گلوتامیک اسید، لوسین و متیونین تشکیل دهنده های خوب مارپیچ آلفا هستند، در حالیکه پرولین، گلایسین، تایروزین و سرین از این نظر بسیار ضعیف هستند. چنین تمایلاتی برای هر تلاش اولیه برای پیشگویی ساختمان دوم از توالی اسیدهای آمینه نقطه مرکزی هستند اما به اندازه کافی قوی نیستند که پیشگویی دقیقی را باعث شوند. عمومی ترین مکان برای مارپیچ های آلفا در ساختمان پروتئین در طول سطح خارجی پروتئین است که یک سمت از مارپیچ به طرف حلال و سمت دیگر به طرف آبگریز داخلی پروتئین است. بنابراین با 6/3 اسیدآمینه در هر دور تمایلی برای زنجیره های جانبی به تغییر از آبگریز به آبدوست با تناوب سه یا چهار اسید آمینه وجود دارد. هر چند این گرایش بعضی مواقع در توالی اسیدهای آمینه دیده می شود اما به اندازه کافی برای پیشگویی ساختمان به تنهایی کافی نیست. زیرا اسید آمینه هایی که به سمت محلول هستند می توانند آبگریز باشند و به علاوه مارپیچ های آلفا می توانند بطورکامل در داخل پروتئین یا کاملاً در معرض حلال باشند.
2-1-1 -2-2- صفحه‌های بتا
ساختار صفحه‌های بتا، ساختار دوم بسیارکشیده و چین‌دار می‌باشند. یکی از تفاوت‌های مهم صفحه‌های بتا با مارپیچ آلفا این است که اسیدآمینه‌هایی که معمولاً در ساختار اول زنجیره پروتئینی با فاصله زیاد از هم قرارگرفته‌اند، برای تشکیل این ساختار در مجاورت یکدیگر قرار می‌گیرند، بنابراین صفحه‌های بتا تمایل به سختی داشته و انعطاف‌پذیری ناچیزی دارند. پیوندهای هیدروژنی بین‌رشته‌ای که میان گروه‌های CO یک رشته بتا و NH رشته بتای مجاور ایجاد می‌شوند، به صفحات بتا پایداری می‌بخشند و باعث می‌شوند که این صفحات ظاهری زیگزاگ داشته باشند.
صفحات زنجیره های پلی پپتیدی مختلف که دارای استخوان بندی پله پله هستند به کمک پیوندهای هیدروژنی زوایایی بین خود ایجاد می کنند. اکسیژن عامل کربنیل یک زنجیره پلی پپتیدی + هیدروژن ازت زنجیره پلی پپتیدی پیوند هیدروژنی ایجاد می کنند که به آنها صفحات چین دار یا ساختمان β گویند.
رشته های بتا برای تشکیل صفحات چین خورده به دو طریق میتوانند با هم میان کنش داشته باشند، یا به حالت صفحه موازی همسو و یا به حالت موازی ناهمسو.
2-1-1-3- ساختار سوم
ساختار سوم، به حالت سه‌بعدی که پروتئین بعد از پیچش به خود می‌گیرد، گفته می‌شود (شکل 5).
اصطلاح ساختمان سوم را به عنوان یک اصطلاح مشترک هم برای طریقه آرایش موتیف‌ها به ساختمان‌های دومِین و هم برای راهی که یک زنجیره پلی‌پپتیدی به چندین دومِین تا می‌خورد بکار می‌بریم. در همه مواردی که مشاهده شده، نشان داده شده است که اگر توالی اسیدهای آمینه در دو دومِین در پروتئین‌های مختلف همولوژی داشته باشند، این دومِین ها ساختمان سوم مشابه دارند.
2-1-1-4- ساختار چهارم
ساختار چهارم به حالت قرارگیری چند پروتئین در فضا کنار یکدیگر گفته می شود (شکل 5). بیشتر پروتئین‌ها از پیوند زنجیرهای پلی پپتیدی مشابه و یا متفاوت ساخته شده‌اند، اتصال بین زنجیرها توسط پیوندهای ضعیف تری برقرار می‌گردد. این ساختار ترتیب قرارگرفتن زیر واحدهای یک پروتئین را شرح می‌دهد و نقش مهمی در توضیح چگونگی شرکت پروتئین در واکنش‌های شیمیایی دارد (20-18).
شکل 5: ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین.
2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی
تعداد 518 پروتئین کیناز در ژنوم انسان وجود دارد که این میزان حدود 7/1 درصد از کل ژنوم انسانی است. 90 مورد از این تعداد شامل تیروزین کینازها هستند که نقش اصلی در پیام رسانی داخل سلولی ایفا می کنند. علاوه براین تیروزین کینازها مهم ترین گروه خانواده ی کینازها هستند که در بیولوژی سرطان مورد مطالعه قرار گرفته اند. این 90 تیروزین کیناز در انسان به دو گروه عمده تقسیم می شوند. گروه اول گیرنده های تیروزین کینازی متصل به غشا هستند و شامل 58 مورد می شوند و گروه دیگر تیروزین کینازهای سیتوپلاسمی هستند که گیرنده نیستند، این گروه شامل 32 مورد می شود. گیرنده های تیروزین کیناز براساس ساختار ناحیه ی خارج سلولی شان به 20 خانواده تقسیم می شوند (شکل6). همچنین گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده ی گیرنده های تیروزین کینازی است (21).
شکل6: دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی. گیرنده های تیروزین کیناز براساس ساختار ناحیه ی خارج سلولی شان به 20 خانواده تقسیم می شوند. هر گیرنده سه ناحیه دارد. ناحیه خارج سلولی، ناحیه گذرنده از غشا و ناحیه کینازی داخل سیتوپلاسمی. گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در دسته چهارم این خانواده قرار دارند.
2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی
فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGF) یک ناحیه‏ی هسته‏ای همولوگ دارند که شامل 120 الی 130 اسیدآمینه است. این ناحیه از کنار هم قرار گرفتن 12 رشته‏ی β ناهمسو (آنتی‏پارالل) (β1-β12) تشکیل شده است (شکل7). محل اتصال هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان (HSGAG) در ناحیه هسته‏ای پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست، متشکل از حلقه β1-β2 و قطعاتی از منطقه دربرگیرنده‏ی β10 و β12 است. یک واحد عملکردی کمپلکس FGF-FGFR متشکل از دو کمپلکس FGF-FGFR-HSGAG با نسبت 1: 1: 1 است که به صورت دایمر متقارن کنار یکدیگر قرار می گیرند. در این دایمر هر لیگاند به طور هم زمان به هر دو گیرنده متصل می شود و هر دو گیرنده نیز با یکدیگر در ناحیه D2 به طور مستقیم در تماس هستند. ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b در شکل 8 نشان داه شده است. هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان متصل به انتهای دیستال غشایی دایمر، موجب تقویت اتصال پروتئین-پروتئین می‏شود. این نواحی علاوه برتسهیل اتصال FGF-FGFR، موجب تثبیت پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست در برابر تجزیه می‏شوند و به عنوان یک مخزن ذخیره سازی لیگاند عمل می‏کنند. این نواحی هم چنین شعاع انتشار لیگاند را تعیین می‏کنند.
علاوه براین ناحیه دیگری به نام پروتئین اتصالی به فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGFBP) که یک پروتئین حامل است می تواند پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست را از طریق آزادسازی آن‏ها از ماتریس خارج سلولی، یعنی در جایی که آن‏ها توسط اتصال به هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان محدود شده‏اند فعال سازد. مشاهده شده است که پروتئین اتصالی موجب افزایش تکثیر سلول‏های فیبروبلاست وابسته به FGF2 می‏شود و یک نقش مهمی در پیشرفت بعضی از سرطان‏ها دارد (22).
شکل7: ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست. 12 رشته‏ی β ناهمسو (آنتی‏پارالل) (β1-β12) و همچنین دو انتهای کربوکسیلی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 1، نشان داده شده است.
شکل8: ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b. ناحیه اتصال فاکتور رشد فیبروبلاستی 10 به نواحی قسمت خارج سلولی گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی 2b در شکل نشان داده شده است.
2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی
فاکتورهای رشد فیبروبلاست پستانداران (FGFs) شامل خانواده‏ای از 18 عضو (FGF1–FGF10) و (FGF16–FGF23) هستند. این فاکتورها از طریق چهار گیرنده تیروزین کینازی (FGFR1-4) و ایزوفرم‏های آن‏ها پیام سلولی ایجاد می‏کنند و از این طریق رشد و نمو جنین و سوخت و ساز بدن بزرگسالان را تنظیم می کنند. انتقال پیام کنترل نشده فاکتور رشد فیبروبلاست می‏تواند منجر به بدخیمی‏های انسانی شود. پروتئین‏های گیرنده ی فاکتور رشد

سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD، FTIR
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع
1-1- مقدمه
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی
فاکتور رشد فیبروبلاستی یا FGF (شکل 1) پروتئینی است که در بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر تقسیم سلولی، تکوین جنین، رگ زایی و بسیاری از فرآیندهای دیگر نقش دارد. به علاوه، این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم به محیط کشت سلولهای بنیادی جنینی انسانی اضافه می شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنیادینگی و بدون تمایز حفظ و تکثیر کرد (1).
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست
گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست(FGFR) در مسیر پیام رسانی سلول نقش کلیدی درتنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می کنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی و توسعه ی مراحل جنینی از جمله وظایفی هستند که در دوران جنینی و بزرگسالی در بدن توسط این گیرنده ها با اتصال به فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرم های موتاسیون یافته ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در سرطان های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.
شکل 1: نحوه عملکرد کلی FGF و .FGFR
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2
پروتئین نوترکیب FGFR2b (شکل2) متعلق به خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGFR) است. این پروتئین دارای 334 اسید آمینه و وزن مولکولی تقریبی 38 کیلودالتون می باشد. تغییرات ژنتیکی در این گیرنده با سرطان های اندومتریال، تخمدان و پستان در ارتباط می باشد. قابل ذکر است که نوع جهش یافته این گیرنده در تعدادی از سرطان ها گزارش شده است که با افزایش پیام مرتبط با این گیرنده در ارتباط می باشد(7).
در این پروتئین نوترکیب با انتقال الگوی موتاسیون مشاهده شده در گیرنده بیان شده در سلول سرطانی، فرم فعال و نوترکیب ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین FGFR2b ایجاد شده است که دارای جهش های مورد نظر می باشد. قابل ذکر است که تهیه ی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئینFGFR2b به صورت خالص این امکان را فراهم می کند که در مطالعات بعدی بتوان اطلاعاتی راجع به ساختار و نیز بررسی برهمکنش پروتئین و لیگاند از جمله اثر مهارکننده های مختلف را روی ناحیه ی کینازی این پروتئین به دست آورد.
بر این اساس در این تحقیق، تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش با فلزاتی که ذکر می شود، بررسی می گردد.
شکل 2: گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2.
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی
گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کینازی (شکل 3) هستند. این گیرنده ها دارای دو ایزو فرم b و cمی باشند که هرکدام به ترتیب در بافت های اپی تلیال و مزانشیمال بیان می شوند. هم چنین هفت گیرنده‏ در خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (شکل3) جای می گیرد که شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 می‏باشد(8). این گیرنده ها در مسیر پیام‏رسانی سلول نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می‏کنند (9). همه آن‏ها دارای یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی که خاصیت تیروزین کینازی دارد هستند. گیرنده ی FGFR2b ایزوفرم اپی تلیال گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی است. ناحیه ی کینازی FGFR2b متشکل از 334 اسیدآمینه می باشد و دارای ساختار به صورت دو ناحیه ی کینازی N-terminal و C-terminal است که توسط یک ناحیه ی اتصال دهنده انعطاف پذیر به هم مرتبط می شوند. این ناحیه ی اتصال دهنده حلقه ی فعال سازی نیز نامیده می شود که در عملکرد فسفریلاسیون تیروزین های ناحیه ی کیناز ی گیرنده نقش مهمی دارد. تقریبا %20 ژن‏های انسانی محصولاتی را کد می‏کنند که در مسیرهای پیام‏رسانی (سیگنالینگ) سلولی مشارکت دارند. تنظیم‏کننده‏های اصلی این مسیرها از طریق واکنش‏های فسفریلاسیون/ دفسفریلاسیون عمل می‏نمایند. آنزیم‏های تیروزین کیناز دسته‏ای از آنزیم‏ها هستند که مسئول فسفریلاسیون اسیدآمینه تیروزین روی پروتئین هدف خود هستند. دو خانواده از آنزیم‏های تیروزین کیناز وجود دارد که عبارتند از گیرنده های کینازی متصل به غشاء و کینازهای سیتوپلاسمی که گیرنده نیستند. ناحیه کاتالیتیکی از تیروزین کیناز شامل مکان اتصال به مولکول ATP ویژه و مکان اتصال به سوبسترا است (10).
الف)
ب)
شکل 3: الف) ساختمان کلی RTK. ب) انواع FGFR.
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون
جهش‏های نقطه‏ای در نواحی خارج سلولی، داخل غشایی و داخل سیتوپلاسمی باعث دایمریزیشن و یا اتوفسفریلیشن بدون ایجاد اتصال بین لیگاند و گیرنده می‏شوند. فعال‏سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون باعث فعالیت کینازی مداوم این آنزیم‏ها می‏شود. مکانیسم‏هایی که این موتاژنز آنزیمی را ایجاد می‏کنند شامل ترانس لوکشن کروموزومی یا موتاسیون های نقطه‏ای است که سبب تغییر در نواحی خارج سلولی، تغییر در ناحیه اتصال به ATP و تغییر در بخش کاتالیتیکی کیناز است. همه‏ی کینازها در فرم فعال از نظر کنفورماسیون شباهت زیادی با هم دارند در حالی که در فرم‏های غیر فعال از نظر ساختاری با یکدیگر متفاوت‏اند. آنکوژنیک تیروزین کینازها تنظیم فرآیندهای سلولی را مختل و یک فنوتیپ پاتولوژیک ایجاد می‏کنند، بنابراین به نظر می‏رسد که این پروتئین‏ها به عنوان یک هدف درمانی جالب توجه برای درمان سرطان باشند (11).
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق
درمطالعات انجام گرفته چندین جهش افزایش انتقال پیام در ناحیه ی کینازی FGFR2b در سرطان‏های اندومتریال، تخمدان و پستان شناسایی گردیده است. هم چنین مشخص شده است که اختلال تنظیمی مسیر پیام‏رسانی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی که می‏تواند ناشی از تغییرات ژنتیکی باشد با ایجاد سرطان ارتباط تنگاتنگی دارد (12). طبق مطالعات صورت گرفته، برخی فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، می توانند سبب اختلال در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و در نتیجه بروز بیماریهای متعددی شوند. یکی از سازوکارهایی که در ارتباط با اثر این ترکیبات روی رشد سلول‏های سرطانی مطرح می‏باشد اثر این ترکیبات بر روی مسیر انتقال پیام با واسطه تیروزین فسفریلاسیون می‏باشد (15-13). طبق دانش ما تاکنون برهمکنش FGFR2b KD با فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، در مطالعه ای گزارش نشده است. بر این اساس در این مطالعه تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b KD بر اثر برهمکنش با سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم با کمک تکنیک های اسپکتروسکوپی شامل فلوئورسانس، CD و FTIR بررسی می‏گردد.
1-3- اهداف طرح
1-3-1- هدف اصلی
بررسی بیان و تخلیص ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-2- اهداف فرعی
بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli.
تخلیص پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی.
بررسی تغییرات ساختاری پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-3- اهداف کاربردی
مشخص شدن عوامل موثر در تغیییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان برخی سرطان ها و بیماری ها موثر باشد.
1-3-4- فرضیات
پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli بیان می شود.
پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص می شود.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با سرب تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با کادمیوم تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با نیکل تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با آلومینیوم تغییر می‏کند.
1-3-5- متغییرها
عنوان متغیر
مستقل
وابسته
کمی
کیفی
تعریف علمی
مقیاس
پیوسته
گسسته
اسمی
رتبه ای
بیان پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
غلظت پروتئین
mg/ml
فلزات سمی
*
*
ppb
بررسی تغییر ساختار سوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک فلوئورسانس تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
Flourescence Intensity
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک پولاریزه تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
CD Spectropolarimeter
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک اسپکترومتر تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
FTIR
cm-1
جدول 1: جدول متغیرها. متغیرهای مورد آزمایش، تعریف علمی هریک و مقیاس اندازه گیری آن ها.
فصل دوم مروری بر متون گذشته
2-1- پروتئین
پروتئینها ماکرومولکول هایی هستند که تمام اعمال مهم در ارگانیسم ها را انجام می دهند، از جمله این اعمال انجام واکنشهای بیوشیمیایی، انتقال مواد غذایی، تشخیص و انتقال پیامها است. بنابراین ژنها خزانه اطلاعات و پروتئینها ماشینهای حیات می باشند. پروتئینها از بهم پیوستن اسیدهای آمینه توسط پیوندهای پپتیدی به صورت یک زنجیره بوجود می آیند. پروتئینها از نظر طول زنجیره (از 30 تا بیش از 000/30 اسید آمینه) و همچنین ترتیب قرار گرفتن اسیدهای آمینه با هم متفاوت هستند.
پروتئین هایی که ما در طبیعت مشاهده می کنیم از طریق انتخاب طبیعی تکامل یافته اند تا عملی خاص را انجام دهند. عملکرد پروتئین ها به ساختار فضایی آنها بستگی دارد. اسیدهای آمینه که با ترتیبی خاص کنار هم قرار گرفته اند (ساختار اول) با پیچ و تاب خوردن در رو و کنار یکدیگر زیر واحدهایی را می سازند (ساختار دوم) که با استفاده از آنها ساختار فضایی پروتئین ساخته می شود(ساختار سوم) و حتی گاه چند واحد این چنینی با قرار گرفتن در کنار هم، خود ساختمان عظیم تری(ساختمان چهارم) را بوجود می آورند.
ساختمان پروتئین ها بطور تجربی بوسیله تکنیک های بلور نگاری پرتوی ایکس و رزنانس مغناطیسی هسته تعیین می شود. در طول 30 سال گذشته ساختمان بیش از 14000 پروتئین شناخته شده است و توالی بیش از 600000 پروتئین مشخص شده است. این موضوع حجم زیادی از اطلاعات را فراهم آورده است که می توان با استفاده از آنها اصول بنیادی ساختمان پروتئین ها را استنتاج کرد. این اصول درک چگونگی ایجاد ساختمان پروتئین ها، رابطه ساختمان و عمل و اساس ارتباط خویشاوندی بین پروتئین ها را آسان کرده است. علم ساختمان پروتئین در مرحله شناسایی و طبقه بندی است که در این مرحله ما میتوانیم اجزای شاخص و الگوها را در پروتئین هایی که ساختمان سه بعدی آنها تعیین شده است مشخص کنیم(17-16).
پروتئینها مواد آلی بزرگ و یکی از انواع درشت ‌مولکول‌های زیستی هستند که از زیر واحدهایی به نام اسید آمینه ساخته شده‌اند. پروتئین‌ها مانند زنجیری از یک کلاف سه‌بعدی هستند که از ترکیب اسیدهای آمینه حاصل می‌شوند. اسیدهای آمینه مثل یک زنجیر خطی توسط پیوند پپتیدی میان گروه‌های کربوکسیل و آمین مجاور ب

دانشگاه علوم پزشکی قزوین
فهرست شکل ها و جداول:
شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFR
شکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2
شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFR
شکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینه
شکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین
شکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی
شکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست
شکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b
شکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن
شکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی
شکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی
شکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPK
شکل 13 : مسیر پیام رسانی PLCy/Ca+2
شکل 14: مسیر پیام رسانی PI3-K/Akt
شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS
شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن
شکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز
شکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1
شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB
شکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T
شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1
شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز
شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ
شکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK
شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ
شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید
شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانین
شکل 28: دیاگرام جابلونسکی
شکل 29: دناتوراسیون پروتئین
شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید
شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا
شکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین
شکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01
شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون
شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین
شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی
شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)
شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy))
شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گراد
شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد
شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد
شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTA
شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز
شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده
شکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CD
شکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIR
شکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
جدول 1: جدول متغیرها
جدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیک
جدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.
فهرست مطالب
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع 3
1-1- مقدمه 4
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی 4
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست 4
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2 5
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی 6
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون 8
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق 9
1-3- اهداف طرح 9
1-3-1- هدف اصلی 9
1-3-2- اهداف فرعی 9
1-3-3- اهداف کاربردی 10
1-3-4- فرضیات 10
1-3-5- متغییرها 10
فصل دوم مروری بر متون گذشته 11
2-1- پروتئین 12
2-1-1- ساختمان پروتئین ها 13
2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی 17
2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 18
2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی 20
2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی 22
2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 25
2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی 29
2-2- فلز چیست؟ 31
2-2-1- فلزات سمی 31
2-2-3- سرب 32
2-2-4-کادمیوم 32
2-2-5- نیکل 33
2-2-6-آلومینیوم 33
2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ 34
2-7-1-ROS 34
2-7-2- MAPK 35
2-7-3- PI3K/Akt 36
2-7-4- HIF 37
2-7-5- NF-kB 38
2-7-6- NFAT 39
2-7-7- AP 40
2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 41
2-8-1- سرب 41
2-8-2- کادمیوم 43
2-8-3- نیکل 46
2-8-4- آلومینیوم 48
2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها 50
2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 50
2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 51
2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها 52
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی 53
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 56
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون 57
2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب 60
2-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب 60
2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 60
2-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان 63
2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین 64
2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب 64
فصل سوم مواد و روش ها 66
3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش 67
3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش 67
3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش 68
3-2- محلول ها و بافرها 69
3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین 69
3-2-2- تهیه ی استوک IPTG 70
3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین 70
3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین 70
3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4% 70
3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12% 71
3-2-7- تهیه ی محلول APS10% 71
3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer) 71
3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 71
3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار 72
3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار 72
3-2-12- تهیه ی Staining Buffer 72
3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 73
3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 73
3-2-15- تهیه بافر SDS 73
3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 73
3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer 74
3-2-18- تهیه بافر دیالیز 74
3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 74
3-2-20- تهیه استوک فلزات 74
3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری 74
3-3- روش انجام کار 75
3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 75
3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب 77
3-3-3- تعیین غلظت پروتئین 83
3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 83
3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 85
3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR 86
3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 87
فصل چهارم یافته ها و نتایج 88
4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد 88
4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد 89
4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد 90
4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 91
4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 92
4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 93
4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 94
4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 98
4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 101
4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104
فصل پنجم بحث و نتیجه گیری 109
5-1- بحث و نتیجه گیری 110
فهرست منابع: 116
….………………………………………………………………………………..Abstract125
چکیده
زمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند. عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFR با بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است. از این گروه گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیام‏رسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.
هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.
یافته‏ها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.
بحث و نتیجه‏گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه‏ کینازی گیرنده‏ نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی 2b که یک پروتئین 38 کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.
کلیدواژه‏ها: گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی،

بذوری مشاهده شد که در سطح شوری صفر میلی‌مول در لیتر قرار داشتند و مقدار آن برابر بود با 78/9 میلی‌گرم قند احیایی در یک گرم بذر که البته تفاوت معنی داری با سطح شوری 50 میلی‌مول بر لیتر نداشت. کمترین میزان قند احیایی در سطح شوری 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام مشاهده شد که میزان آن 95/7 میلیگرم در یک گرم بذر بوده است.
نمودار 4-12 اثر شوری بر روی میزان قند احیایی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد تأثیر ماده شیمیایی بر روی قند احیایی در بذر همانطور که در نمودار 4-13نشان داده شده، بالاترین میزان قند احیایی در زمانی مشاهده شده که بذور تحت تأثیر جیبرلیک اسید پرایمینگ قرار داشتند و مقدار آن برابر بود با 15/10 میلی‌گرم قند احیایی در یک گرم بذر اما این تیمار با بذوری که تحت تأثیر پرایمینگ قرار نداشتند از نظر میزان قند‌های احیایی تفاوت معنی داری نداشتند. کمترین میزان

(C)
94/4*
26/3*
**87/6
20
AB
**56/10
**14/4
**07/12
10
AC
**74/82
**73/19
**06/161
8
BC
**28/9
**78/3
**47/9
40
ABC
50/2
74/1
92/1
180
خطای آزمایش
05/26
06/15
34/9
CV
**معنی دار در سطح 1 درصد و*معنی دار در سطح 5 درصد
4-5 قند کل:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-9 تأثیر فاکتور پرایمینگ، شوری و فاکتور زمان همچنین تمامی اثرات متقابل آنها در سطح 1% اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند.
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد همان گونه که در نمودار 4-9 مشاهده می‌شود بالاترین میزان قند کل مربوط به سطح شوری 50 میلی‌مول در لیتر نمک طعام و کمترین میزان قند کل مربوط به سطح شوری 100میلی‌مول در لیتر نمک طعام می‌باشد.
نمودار 4-9: اثر شوری بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد فاکتور ماده شیمیایی باید بیان کرد که با توجه به نمودار 4-10 بالاترین میزان قند کل مربوط به تیمار پرایمینگ با سالسیلیک اسید بوده که برابر است با 06/18 و کمترین میزان قند کل مربوط به تیمار پرایمینگ با جیبرلیک اسید می‌باشد که میزان آن برابر بود با 5/12 میلیگرم قند کل در یک گرم بذر که این میزان حتی از بذور تیمار نشده کمتر بود.
نمودار 4-10: اثر پرایمینگ های مختلف بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد فاکتور زمان باید بیان شود که با مقایسه میانگین زمان‌های مختلف با آزمون دانکن بر طبق نمودار 4-11 بالاترین میزان قند کل مربوط به زمان 36 ساعت بود که میزان متوسط قند کل در این زمان برابر بود با 78/15 میلی گرم قند کل در یک گرم بذر و حداقل میزان قند کل مربوط بود به زمان 12 ساعت که مقدار آن برابر بود با 73/13 میلیگرم قند کل در یک گرم بذر. بر طبق این نمودار مشاهده می‌شود که با گذشت زمان بر میزان قندکل بذر افزوده گردیده است.
نمودار 4-11: اثر زمان بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با توجه به جدول 4-10 که نشان دهنده مقایسه میانگین‌های اثر متقابل شوری و پرایمینگ بر مقدار قند کل می‌باشد مشاهده شد که بالاترین میزان قند کل زمانی بدست می‌آید که بذور تحت تیمار سلیسلیک اسید پرایمینگ قرار داشتند و میزان شوری نیز 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام بود که در این حالت مقدار آن برابر بود با 13/19 میلی‌گرم قندکل بر یک گرم بذر و حداقل مقدار قند کل زمانی حاصل گردید که بذور تحت هیچ گونه تیماری قرار نگرفته بودند و سطح شوری نیز 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام بوده است. میزان قند کل در این حالت 53/11 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-10 اثر متقابل شوری و پرایمینگ بر قند کل
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150
میلی‌مول
100
میلی‌مول
50
میلی‌مول
میلی‌مول
میزان شوری
پرایمینگ
53/11 k
53/12ijk
47/12 ijk
49/12ijk
08/13 g-j
09/14 e-h*
بدون پرایم
4/13 f-j
41/14efg
7/13 f-i
75/13 f-i
23/15 de
34/13 f-j
جیبرلیک اسید
59/12 h-k
38/12ijk
56/12 ijk
86/11jk
09/13 g-j
53/12ijk
آب
13/19 a
96/17ab
85/17ab
33/18ab
88/17ab
19/17bc
سالسیلیک اسید
81/17ab
92/15 cd
77/17ab
75/14 def
95/16bc
42/18ab
نمک طعام
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
با مشاهده جدول 4-11 که بیانگر مقایسه میانگین‌های اثرات متقابل پرایمینگ و زمان به روش دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد بالاترین میزان قند کل در حالتی بدست می‌آید که بذور تحت تیمار سالیسلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته و 36 ساعت از زمان شروع خیس کردن گذشته باشد. در این حالت میزان قند کل برابر بود با 7/22 میلی‌گرم قند کل به یک گرم بذر از سوی دیگر کمترین میزان قند کل نیز زمانی بدست آمد که بر روی بذور هیچ‌گونه تیماری صورت نگرفته بود و تنها 12 ساعت از شروع خیس کردن بذور گذشته باشد که میزان قند کل بذر در این حالت 84/13 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-11 اثر متقابل پرایمینگ و زمان بر قند کل
نمک طعام
سالسیلیک اسید
آب
جیبرلیک اسید
بدون پرایم
پرایمینگ
ساعت
پس از
خیس شدن بذر
1/13ef
42/13ef
30/11 g
99/16 d
84/13 e*
12 ساعت
86/17 cd
48/18 c
37/13ef
19/13ef
58/11 g
24 ساعت
84/19 b
27/22 a
84/12ef
74/11 g
67/12 f
36 ساعت
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
اثر متقابل دیگری که باید با آن توجه شود اثر متقابل شوری و زمان می‌باشد بر طبق جدول 4-12 که نشان دهنده مقایسه میانگین این اثر متقابل می‌باشد بالا ترین مقدار قند کل در زمانی بدست آمد که بذور تحت تنش شوری نبودند یعنی در زمانی که از آب مقطر جهت آب دهی به بذور استفاده شده و در زمان 36 ساعت پس از خیس کردن بذور در این مورد میزان قند کل بذر 35/17 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر بود. کمترین میزان قند کل نیز در حالتی مشاهده شد که بذور تحت تنش شوری 100 میلی‌مول نمک طعام در لیتر قرار داشتند و تنها 12 ساعت از شروع خیس شدن بذرها می‌گذشت در این حالت میزان قند کل در بذور برابر بود با 38/13 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-12 اثر متقابل شوری و زمان بر قند کل
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150 میلی‌مول
100 میلی‌مول
50
میلی مول
میلی‌مول
میزان شوری
ساعت
پس از
خیس شدن بذر
46/13ef
05/14 def
31/13 f
38/13ef
04/14 def
13/14 def*
12 ساعت
72/14 cd
5/14cde
40/15bc
48/15bc
42/15bc
86/13 def
24 ساعت
5/16ab
37/15bc
90/15 b
84/13 def
27/16 b
35/17 a
36 ساعت
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
در نهایت در مورد اثر سه جانبه زمان، شوری و پرایمینگ باید گفته شود که بر اساس جدول 4-13 بیشترین میزان قند زمانی حاصل گردید که بذور تحت تنش شوری 250 میلی‌مول بر لیتر نمک طعام بودند و تیمار سالسیلیک اسید پرایمینگ بر روی آنها انجام شده بود همچنین 36 ساعت از زمان خیس شدن بذور می‌گذشت در این حالت میزان قند کل بذور برابر بود با 38/26 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر و کمترین مقدار قند کل نیز در زمانی بدست آمد که بذور تحت تنش شوری 100 میلی‌مول در لیتر نمک طعام قرار گرفته بودند و تیمار جیبرلیک اسید پرایمینگ بر روی آنها صورت گرفته بود همچنین تنها 12 ساعت از زمان خیس شدن بذور می‌گذشت در این حالت مقدار قند کل برابر بود با 36/10 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر.
جدول 4-13 اثر متقابل پرایمینگ، شوری و زمان بر روی قند کل
پرایمینگ
سطح شوری
ساعت پس از خیس شدن بذر
بدون پرایم
جیبرلیک اسید
آب
سالیسیلیک اسید
نمک طعام
12
23/14
4/17
18/11
63/13
22/14
24
29/12
07/12
26/13
59/15
09/16
36
75/15
56/10
15/13
35/22
94/14
50
12
06/14
84/19
7/11
12
62/12
50
24
37/11
82/12
66/14
07/19
18/19
50
36
8/13
03/13
92/12
57/22
04/19
100
12
89/13
73/16
36/10
16/13
77/12
100
24
80/10
62/12
44/13
74/20
83/19
100
36
80/12
9/11
78/11
09/21
64/11
150
12
66/13
92/15
87/11
28/13
82/11
150
24
86/11
34/14
26/13
92/18
62/18
150
36
9/11
85/10
54/12
35/21
86/22
200
12
22/14
84/15
63/11
67/15
89/12
200
24
22/12
69/14
9/11
31/18
37/15
200
36
14/11
7/12
61/13
9/19
51/19
250
12
13
22/16
04/11
77/12
27/14
250
24
96/10
61/12
7/13
24/18
08/18
250
36
62/10
38/11
03/13
38/26
07/21
در مورد فاکتور شوری باید اظهار داشت بر طبق گزارشات گیل و همکاران (2001) بذور سورگومی که تحت تنش شوری قرار گرفته بودند دارای سطوح بالاتری از قند کل نسبت به بذور شاهد بودند که این تأثیر تنها در سطح 50 میلی‌مول در لیتر قابل مشاهده بوده و در سطوح بالاتر شوری میزان قند کل نسبت به بذور تیمار نشده کاهش یافت. از سوی دیگر بر طق مشاهدات سیوریتیپ و همکاران (2003) سطوح قند کل در بذور گیاه هندوانه‌ای که در معرض تنش شوری قرار داشت به طور قابل توجهی کاهش یافت که این نتایج با نتایج تحقیق حاضر در یک راستا می‌باشند.در رابطه با تیمار هالوپرایمینگ بر طبق تحقیقات فرهودی و همکاران (2010) بر روی خربزه رقم تخم‌قند مشاهده شد که پیش‌تیمار سازی بوسیله نمک سبب افزایش میزان کربوهیدرات گردید است همچنین بر طبق گزارش سیوریتیپ و همکاران (2003) در گیاه طالبی پیش‌تیمارسازی بوسیله نمک سبب افزایش کربوهیدرات محلول گردیده است نتایج تحقیقات فوق با این تحقیق همراستا بوده و نشانگر این بود که تیمار هالوپرایمینگ سبب افزایش میزان قند کل نسبت به بذور تیمار نشده می‌گردد. بر طبق گزارش نوربخشیان و همکاران (2011) بذور گیاه اسپرسی که تحت تیمار هیدروپرایمنیگ قرار گرفته بود در شرایط تنش شوری دارای میزان بالاتری قندکل بودند در تحقیق حاضر فقط در بالاترین حالت تنش یعنی 250 میلی‌مول نمک طعام در لیتر افزایش مقدار قند کل در بذور گیاه ماریتیغال نسبت به بذور پرایم نشده مشاهده گردید. بنا بر گزارش سیوریتیپ و همکاران (2003) بذور هندوانه‌ای که تحت تیمار هالوپرایمینگ قرار گرفته بودند نسبت به بذور شاهد در تنش شوری دارای مقدار بالاتری قند کل بودند نتایج تحقیق فوق با تحقیق حاضر کاملاً در یک راستا بوده. در تحقیق حاضر در کلیه سطوح تنش شوری بذور ماریتیغالی که تحت تنش شوری قرار داشتند دارای میزان بالاتری قند کل نسبت به بذور تیمار نشده بودند. در تحقیقی که توسط حمید و همکاران (2008) بر روی بذور گندمی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید قرار گرفته بودند انجام شد مشاهده گردید که در شرایط تنش شوری این بذور دارای مقدار بالاتری قند کل نسبت به بذور شاهد بودند که نتیجه این تحقیق با تحقیق حاضر در یک راستا می‌باشد زیرا در تمامی سطوح شوری مقدار قندکل در بذور ماریتیغالی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته بودند از بذور پرایم نشده بالاتر بود. بنا بر گزارش کیم و همکاران بذور برنجی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته بودند در شرایط تنش شوری دارای میزان بالاتری قند کل بودند بنابر نتایج تحقیق حاضر در تنش‌های بالاتر از 50 میلی‌مول نمک طعام در لیتر بذور ماریتیغالی که با جیبرلیک اسید پرایم شده بودند دارای سطوح بالاتر قند کل نسبت به بذور پرایم نشده بودند که نتایج هر دو تحقیق در یک راستا می‌باشند.
4-6 قند احیایی:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-9 تأثیر فاکتور ماده شیمایی و فاکتور شوری در سطح 1% معنی‌دار گردید اما اثر زمان بر روی میزان قندهای احیایی معنی دار نبود. همچنین اثر متقابل شوری و زمان نیز معنی دار نبود اما دیگر اثرات متقابل در سطح 1% معنی‌دار بودند.
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد همان گونه که در نمودار 4-12 مشاهده می‌شود بالاترین میزان قند احیایی در

همکاران استفاده می‌گردد.
ب: قند احیایی:
جهت اندازه گیری قند احیایی از روش روش میلر استفاده گردید.
د: قند غیر احیایی:
جهت اندازه‌گیری قند غیر احیایی از روش شاهد صدیقی و اجمل خان استفاده گردید.
6- محاسبات آماری و رسم جداول:
جهت انجام تجزیه آماری از نرم‌افزار Mstat-c و جهت رسم جداول از نرم‌افزار Excel استفاده گردید.
فصل چهارم
نتایج و بحث
نتایج و بحث:
نظر به این که بذور گیاه ماریتیغال بوسیله مواد شیمیایی مختلف پرایم گردید و سپس این بذور در معرض سطوح مختلف تنش شوری قرار گرفتند پس از دو سری آزمایش که که در یکی خصوصیات جوانه‌زنی و در دیگری سطوح قند در درون بذر مورد مطالعه قرار گرفت. همانطور هم که قبلاً اشاره شده بطور کلی در این تحقیق صفات زیر مورد بررسی قرار گرفت.
1- درصد جوانه زنی
2- متوسط جوانه زنی در روز
3- متوسط سرعت جوانه زنی در روز
4- سرعت جوانه‌زنی
5- میزان قند کل
6- میزان قند احیایی
7- میزان قند غیراحیایی
4-1 متوسط سرعت جوانه‌زنی:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-1 تأثیر فاکتور پرایمینگ و تأثیر فاکتور شوری در سطح 1% معنی‌دار گردید اما اثر متقابل آنها معنی دار نبود.
جدول 4-1: جدول تجزیه واریانس تأثیر پرایمینگ‌های مختلف تحت تنش‌های شوری بر روی شاخص‌های جوانه‌زنی
میانگین مربعات (MS)
منابع تغییر
Df
متوسط سرعت جوانه‌زنی
متوسط جوانه‌زنی در روز
سرعت جوانه‌زنی
درصد جوانه‌زنی
شوری (A)
4
**54/3
** 97/0
**38/78
**44/693
پرایمینگ(B)
5
**51/6
**22/0
**45/63
**16/1274
AB
20
ns72/0
**09/0
ns 80/7
ns 73/141
خطای آزمایش
60
48/0
04/0
62/4
40/94
CV
07/21
31/8
08/21
06/21
**معنی دار در سطح 1 درصد و*معنی دار در سطح 5 درصد
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن 5 % همان گونه که در نمودار 4-1 مشاهده می‌شود بالاترین میزان متوسط سرعت جوانه‌زنی با متوسط 87/3 مربوط به سطح شوری 100 میلی‌مول در لیتر کلرید سدیم و پایین‌ترین متوسط سرعت جوانه‌زنی با متوسط 44/2 در روز مربوط به سطح شوری 250 میلی‌مول در لیتر کلرید‌سدیم بود.
نمودار 4-1: اثر سطوح مختلف شوری بر روی متوسط سرعت جوانه‌زنی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
بر اساس نمودار شماره 4-2، مقاسیه میانگین‌های پرایمینگ‌های مختلف اختلاف معنی داری بین تیمارهای بدون پرایم، جیبرلیک اسید، سالیسیلیک اسید و آب نشان نداد و تنها در تیمار با کلرید سدیم کاهش قابل توجهی در متوسط سرعت جوانه زنی مشاهده گردید.
نمودار 4-2: تأًثیر پرایمینگ‌های مختلف بر روی متوسط سرعت جوانه‌زنی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با توجه به جدول 4-2 که نشان دهنده اثر متقابل شوری و پرایمینگ می‌باشد بالاترین متوسط سرعت جوانه‌زنی مربوط به اثر متقابل شوری 50 میلی‌مول در لیتر و هیدروپرایمینگ که مقدار آن 48/4 می‌باشد و حداقل متوسط سرعت جوانه‌زنی تحت تأثیر اثر متقابل شوری در سطح 250 میلی‌مول در لیتر و هالوپرایمینگ مشاهده شد که میزان آن برابر بود با 9/0 .
جدول 4-2 اثر متقابل سطوح مختلف شوری و پرایمینگ بر روی متوسط سرعت جوانه‌زنی
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150
میلی‌مول
100
میلی‌مول
50
میلی‌مول
میلی‌مول
میزان شوری
پرایمینگ
29/2 cd
38/3abc
19/3 a-d
24/4 a
48/3abc
76/3ab*
بدون پرایم
62/2bcd
81/3ab
24/3 a-d
95/3ab
4ab
28/4 a
جیبرلیک اسید
76/2bcd
52/3abc
14/3 a-d
72/3ab
48/4 a
33/4 a
آب
62/3abc
48/3abc
29/3 a-d
95/3ab
43/3abc
48/3abc
سالیسیلیک اسید
9/0 e
2 de
09/3 a-d
48/3abc
2 de
95/1 de
نمک طعام
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
مشاهده می‌شود تأثیر تیمار سالیسیلیک اسید بر روی متوسط سرعت جوانه‌زنی تحت تنش شوری در سطوح پایین شوری تأثیری قابل توجه بر روی این شاخص جوانه زنی نداشت اما در سطوح بالا شوری تأثیر مثبت این پرایمینگ مشاهده می‌شود نتایج مشاهده شده با گزارش سالاریزاده و همکاران (2012) که بیان نموده بودند که تیمار سالیسیلیک اسید پرایمینگ در کاهش اثرات منفی تنش شوری بر روی متوسط سرعت جوانه‌زنی موثر است در یک راستا می‌باشد. در ادامه نتایج بدست آمده در مورد تأثیر هیدروپرایمینگ بر روی این شاخص جوانه‌زنی حاکی از آن بود که نتایج این تحقیق با تحقیق علی‌آبادی فراهانی و معروفی (2011) که بر روی گیاه شنبلیله انجام شده بود همخوانی نداشت. با توجه به تحقیقات گذشته و اثر گونه و حتی واریته گیاهی بر نتیجه اثر پرایمینگ در تنش شوری می‌توان این عدم تطابق نتایج را به تفاوت گونه‌های گیاهی و همچنین تفاوت در مدت پرایمینگ و غلظت محلول پرایمینگ مورد استفاده نسبت داد.
4-2: متوسط جوانه‌زنی در روز:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-1 تأثیر فاکتور پرایمینگ و تأثیر فاکتور شوری و همچنین اثر متقابل آنها در سطح 1% معنی‌دار گردیده‌اند .
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن 5% همان گونه که در نمودار 4-3 مشاهده می‌شود بالاترین میزان متوسط جوانه‌زنی در روز مربوط به سطح شوری 250 میلی‌مول در لیتر است که برابر با 865/2 می‌باشد و کمترین متوسط جوانه‌زنی در روز مربوط به سطح شوری صفر میلی‌مول در لیتر است که معادل 256/2 می‌باشد.
نمودار 4-3: اثر سطوح مختلف شوری بر روی متوسط جوانه‌زنی در روز
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
بر اساس نمودار 4-4 مقاسیه میانگین‌های پرایمینگ‌های مختلف اختلاف معنی داری بین تیمارهای بدون پرایم با تیمارهای جیبرلیک اسید، سالیسیلیک اسید و آب نشان داده شد که بالاترین میزان متوسط جوانه‌زنی در روز مربوط به بذور پرایم نشده بود که در این بذور مقدار متوسط جوانه‌زنی در روز برابر با 61/2 بود از سوی دیگر کمترین متوسط جوانه‌زنی در روز در مورد تیمار جیبرلیک اسید مشاهده گردید که میزان آن معادل 36/2 می‌باشد.
نمودار 4-4: تأثیر پرایمینگ های مختلف بر روی متوسط جوانه‌زنی در روز
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با توجه به جدول 4-3 مقایسه میانگین اثر متقابل شوری و پرایمینگ مشاهده می‌شود بیشترین متوسط جوانه زنی در روز در شوری 250 میلی‌مول در لیتر و هیدروپرایمینگ مشاهده گردید که مقدار آن برابر بود با 14/3 از سوی دیگر کمترین متوسط جوانه‌زنی در روز در سطح شوری صفر و تیمار هیدروپرایمینگ مشاهده شد که میزان آن 06/2 بود. بطور کلی مشاهده می‌شود در سطوح شوری بالا بر مقدار متوسط جوانه‌زنی در روز بذور ماریتیغال افزوده می‌شود.
جدول 4-3 اثر متقابل شوری و پرایمینگ بر متوسط جوانه‌زنی در روز
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150
میلی‌مول
100
میلی‌مول
50
میلی‌مول
میلی‌مول
میزان شوری
پرایمینگ
83/2 ab
8/2 abc
4/2 d-h
39/2 e-h
68/2 b-e
58/2 b-g*
بدون پرایم
65/2 b-e
69/2 b-e
37/2 e-h
18/2 h
11/2 h
14/2 h
جیبرلیک اسید
14/3 a
38/2 e-h
34/2 e-h
24/2 fgh
09/2 h
06/2 h
آب
07/3 a
79/2 a-d
63/2 b-f
36/2 e-h
17/2 h
08/2 h
سالسیلیک اسید
64/2 b-e
62/2 b-f
2/2 gh
17/2 h
31/2 e-h
41/2 c-h
نمک طعام
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
در رابطه با تأثیر هیدروپرایمینگ در شرایط تنش شوری بر روی متوسط جوانه‌زنی بذور ماریتیغال مشاهده گردید که باعث کاهش این شاخص جوانه‌زنی می‌گردد که این نتیجه با نتایج بدست آمده بر روی زیره سبز (نعمت‌الهی و همکاران( 2009) و برنج افضل و همکاران (2012) مطابقت دارد. در مورد تیمار هالو پرایمنیگ باید ذکر شود که این تیمار سبب کاهش متوسط جوانه‌زنی در روز در بذور تیمار شده گردید که این نتیجه با نتیجه تحقیق افضل و همکاران (2012) که بیان کرده بودند تیمار هالوپرایمنیگ سبب کاهش متوسط زمان جوانه‌زنی بذور برنجی که تحت تنش شوری قرار داشتند می گردد همخوانی داشت. نتایج بدست آمده در این تحقیق در رابطه با تأثیر سالیسیلیک اسید بر روی متوسط جوانه‌زنی در روز حاکی از آن بود که این تیمار در رابطه با کاهش این زمان دارای تأثیر مثبت بوده و سبب کاهش این شاخص جوانه زنی گردید همچنین با بالاتر رفتن سطوح شوری بر میزان این شاخص افزوده می‌شود به گونه‌ای که بالاترین میزان متوسط جوانه‌زنی در روز مربوط به تیمار 250 میلی‌مول بر لیتر نمک طعام بود. نتایج این تحقیق با تحقیق خان و همکاران (2009) ، امجد و همکاران (2007) که بیان نموده بودند تیمار سالیسیلیک اسید سبب کاهش متوسط جوانه‌زنی در روز بذور فلفل تند می‌گردد همراستا بوده همچنین در گزارشی دیگر در مورد گیاه ذرت احمد و همکاران (2012) گزارش نمودند که سالیسیلیک اسید پرایمینگ در شرایط تنش شوری سبب کاهش متوسط زمان جوانه‌زنی می‌گردد. مشاهده می‌شود کاهش متوسط جوانه‌زنی در روز در سطوح پایین‌تر شوری بیشتر از سطوح بالای شوری می‌باشد و تأثیر پرایمینگ در سطوح پایین شوری بیش از تأثیر آن در سطوح بالای شوری است همچنین در کلیه تیمارها پرایمینگ سبب کاهش این شاخص جوانه‌زنی نسبت به تیمار شاهد میگردد.
4-3: سرعت جوانه‌زنی :
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-1 تأثیر فاکتور ماده شیمایی و تأثیر فاکتور شوری در سطح 1% معنی‌دار گردید اما اثر متقابل آنها اختلافی نشان نمی‌دهد.
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد همان گونه که در نمودار 4-5 مشاهده می‌شود بالاترین میزان سرعت جوانه زنی مربوط به سطح شوری 100 میلی‌مول در لیتر می‌باشد که معادل 55/12 می‌باشد و کمترین سرعت جوانه‌زنی مربوط به سطح شوری 250 میلی‌مول بر لیتر نمک طعام بوده که در این سطح شوری سرعت جوانه‌زنی برابر با 24/6 بود.
نمودار 4-5 اثر سطوح مختلف شوری بر روی سرعت جوانه‌زنی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با مقایسه میانگین مواد شیمیایی مختلف که در نمودار 4-6 مشاهده می‌شود مشخص گردید که بیشترین سرعت جوانه‌زنی مربوط به تیمار با آب بوده که این تیمار با تیمار جیبرلیک اسید تفاوت چندانی نداشتند. سرعت جوانه زنی در تیمار با آب برابر با 67/11 بود. حداقل سرعت جوانه زنی در تیمار با نمک طعام مشاهده شد که مقدار آن 07/7 بود.
نمودار 4-6: اثر پرایمینگ های مختلف بر سرعت جوانه زنی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با توجه به جدول 4-4 که نشان دهنده مقایسه میانگین‌های اثرات متقابل شوری و پرایمینگ می‌باشد مشاهده می‌شود که بالاترین سرعت جوانه‌زنی در حالتی است که بذور تحت تیمار هیدروپرایمینگ قرار گرفته بودند و سطح شوری محیط نیز 50 میلی‌مول در لیتر نمک طعام بود که در این حالت سرعت جوانه‌زنی 36/15 مشاهده شد از سوی دیگر کمترین سرعت جوانه‌زنی مربوط به شرایطی بود که بذور تحت تیمار هالوپرایمینگ قرار داشتند و در سطح

قند می‌باشد ( باسرا و همکاران، 2005 ). با توجه به مطالب ذکر شده تیمار هیدرو‌پرایمنگ بر روی مقدار قند برخی گونه‌های گیاهی مؤثر بوده و مقدار قندهای مختلف را تغییر می‌دهد البته انتظار می‌رود که این تأثیر در گونه‌های گیاهی و واریته‌های مختلف تغییر کند.
2-11 تأثیر هالوپرایمینگ ( پیش تیمار سازی با نمک ) بر میزان قند :
در مطالعه‌ای که بر روی گیاه هندوانه انجام شده مشخص گردید که به طور کلی با افزایش میزان شوری از میزان قند کل بذر کم می‌شود اما مشاهده شده است که میزان قند کل در بذور گیاه هندوانه ای که با نمک طعام پرایم شده و دچار تنش شوری شده است نسبت به بذوری که پرایم نشده بودند از میزان بیشتری قند کل برخوردار بودند ( سیوریتیپ و همکاران، 2003 ). بر طبق تحقیقات انجام شده بذور گندمی که تحت تیمار هالوپرایمینگ به کمک نمک طعام قرار گرفته بودند و در شرایط تنش شوری قرار داشتند دارای میزان کمتری از قندهای کل، احیایی و غیر احیایی نسبت به بذور تیمار نشده بودند ( افضل و همکاران، 2008 ). در مطالعه‌ای دیگر که بر روی گیاه جو انجام شد مشاهده گردید که پرایمینگ نمک بر روی میزان قند ریشه در شرایط تنش شوری اثر قابل ملاحظه‌ای نداشت همچنین مشاهده گردید که همین تیمار بر میزان قند ساقه دارای اثر قابل توجهی بوده به طوری که موجب افزایش 1/12 درصدی میزان قند در ساقه گشته است ( انور و همکاران، 2011 ). با توجه به مطالب ذکر شده تیمار هالوپرایمینگ بر روی مقدار قند برخی گونه‌های گیاهی مؤثر بوده و مقدار قندهای مختلف را تغییر می‌دهد البته انتظار می‌رود که این تأثیر در گونه‌های گیاهی و واریته‌های مختلف تغییر کند.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1 منظور از آزمایش
بطوریکه قبلاً هم اشاره شده منظور از اجرای این تحقیق بررسی اثرات پرایم‌های شیمیایی و هورمونی در کنترل اثرات سؤ شوری خاک بر روی گیاه مارتیغال می‌باشد. با توجه به این که حساسترین مرحله رشد گیاه مرحله جوانه‌زنی و رشد اولیه گیاهچه (سیدلینگ) می‌باشد، لذا اثر پرایمینگ بر میزان جوانه‌زنی، خصوصیات رشد و میزان قند گیاه‌چه که در معرض شوری قرار گرفته‌اند مورد مطالعه قرار گرفت.
3-2 محل اجرای آزمایش
کلیه آزمایشهای این تحقیق در آزمایشگاه شرکت درسا لارستان واقع در شهرک صنعتی لارستان انجام گرفت.
3-3 طرح آزمایش
آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام گرفت که فاکتورها و تیمارهای آزمایشی آن به شرح زیر می‌باشد.
(1)- فاکتور پرایمینگ شامل پنج تیمار که عبارت بودند از
الف: سالیسیلیک اسید
ب: جیبرلیک اسید
ج: نمک طعام
د: آب
ه: بدون پرایم
(2)- فاکتور شوری در شش سطح شامل 0، 50، 100، 150، 200 و 250 میلی‌مول نمک طعام بر لیتر
3-4 طرز اجرای آزمایش
(1)- ضد عفونی بذور
بمنظور تعیین موثرترین ماده و زمان لازم برای ضد عفونی بذور پیش آزمایشهایی بر روی چند ماده ضد عفونی کننده با زمانهای مختلف انجام گرفت، سرانجام مشخص گردید که بهترین نتیجه زمانی حاصل می‌شود که بذرها برای مدت 30 ثانیه در اتانول 95% قرار گیرند.
(2)- پرایمینگ بذور
با توجه به اینکه در حین انجام عمل پرایمینگ، بذور به اکسیژن نیاز دارند لذا پیش آزمایشی‌هایی ترتیب داده شد که بهترین روش جهت هوادهی بذور مشخص گردد. در ابتدا با استفاده از پمپ هوا که از طریق دمیدن هوا را به محلول پرایمینگ وارد می‌کرد هوادهی انجام گردید اما استفاده از این روش قوه نامیه بذور کاهش پیدا کرد و مشخص گردید که بذور ماریتیغال به شرایط غرقابی حساس می‌باشند و این روش جهت پرایمینگ بذور کارایی ندارد لذا از روشی دیگر جهت پرایمینگ بذور استفاده کردیم که در این روش از یک محفظه دوار هوادهی استفاده گردید که این روش موثر بود و تأثیر سویی بر قوه نامیه بذور برجای نمی‌گذاشت.
علاوه بر این بمنظور یافتن بهترین مدت زمان جهت پرایمینگ بذور پیش‌آزمایشی ترتیب داده شد. مشخص گردید که حداکثر جذب آب توسط بذور 10 ساعت پس از قرار گرفتن بذور در محلول پرایمینگ بوقوع می‌پیوندد. الف: هیدروپرایمینگ ( پیش‌تیمار سازی با آب )
جهت پیش تیمار سازی بذور با آب یا هیدروپرایمینگ 100 گرم بذر ضد عفونی شده را در محفظه پرایم کن که تا نیمه آب داشت قرار دادیم. دستگاه را به مدت 10 ساعت روشن گذاشته و به کمک یک گیربکس سرعت چرخش را بر روی یک دور در ثانیه تنظیم نمودیم. در نهایت پس از پایان 10 ساعت بذرها را بیرون آورده و آب کشی کرده و به مدت چند روز آنها را در فضای باز در سایه قرار داده تا کلیه بذور خشک گشته و جهت آزمایشها مورد استفاده قرار گیرند.
ب: هالوپرایمینگ ( پیش‌تیمار سازی با نمک )
جهت پیش‌تیمار سازی با نمک ابتدا آب‌نمکی با غلظت 5/0 درصد تهیه کرده و سپس مراحل گفته شده در مورد هیدروپرایمینگ را در مورد هالوپرایمینگ تکرار کردیم.
ج: جیبرلیک اسید پرایمینگ ( پیش‌تیمار سازی با جیبرلیک اسید )
جهت پیش‌تیمار سازی با جیبرلیک اسید از محلول جیبرلیک اسید با غلظت 200 میلی‌گرم در لیتر استفاده کرده و مراحل ذکر شده در مورد هیدروپرایمینگ را تکرار گردید.
د: سالیسیلیک اسید پرایمینگ ( پیش‌تیمار سازی با سالیسیلیک اسید )
جهت پیش تیمار سازی با سالیسیلیک اسید از محلول 50 پی‌پی‌ام سالیسیلیک اسید که قبلاً تهیه شده بود استفاده کرده و مراحل ذکر شده در مورد هیدروپرایمینگ مجدداً تکرار گردید.
ه: شاهد (بدون پرایم)
در این مورد بذور بدون هیچ پیش‌تیماری در آزمایشات مورد استفاده قرار می‌گرفت.
(3)- جوانه‌زنی بذر
برای هر واحد آزمایشی با توجه به تیمار فاکتور پرایمینگ مربوطه ( هیدروپرایمینگ و … ) 50 عدد بذر سالم و یکنواخت را انتخاب نموده و در داخل پتری‌دیش‌های محتوی کاغذ صافی قرار داده شدند. سپس به هر پتری‌دیش به میزان هفت سی‌سی از محلول نمک تیمار شوری مربوطه ( 0، 50، 100، 150، 200 و 250 میلی‌مول در لیتر ) که قبلاً آماده شده بودند اضافه می‌گردید. جهت تعیین میزان تبخیر و آبیاری مجدد در طول دوره آزمایش پتری‌دیش‌ها را وزن کرده و در ژرمیناتور قرار داده شدند. دستگاه ژرمیناتور به گونه‌ای تنظیم شده بود که دمای داخل آن 25 درجه سانتیگراد و مدت زمان روشنایی آن در شبانه‌روز 12 ساعت باشد.
(4)- اندازه گیری قند:
بمنظور استخراج و اندازه‌گیری قند در تیمارهای مختلف، برای هر واحد آزمایشی ده عدد بذر ضد عفونی شده را وزن نموده و پس از قرار دادن در یک پتری‌دیش با توجه به تیمار مربوط با محلول 0، 50، 100، 150، 200 و 250 میلی‌مول نمک طعام خیس می‌گردیدند. پس از گذشت 12، 24 و 36 ساعت 1/0 گرم ماده خشک از هر پتری‌دیش‌ جدا و جهت استخراج قند مورد استفاده قرار می‌گرفت.
الف: استخراج قند:
بمنظور استخراج قند از روش اموکولو استفاده گردید. در این روش ماده گیاهی در اتانول سائیده شده تا به صورت یک ماده یکنواخت در آید. سپس طی چند مرحله محلول فوق را گرم کرده و به آن الکل اضافه می‌گردید. در نهایت این محلول را صاف کرده و جهت اندازه گیری قند از آن استفاده می‌شد.
ب: تهیه معرف آنترون :
برای تهیه معرف آنترون ابتدا 152 سی‌سی اسید سولفوریک 98 درصد با 60 سی‌سی آب مقطر در زیر هود به آرامی رقیق کرده و بعد از خنک شدن محلول اسید میزان 3/0 گرم پودر آنترون به را به آن اضافه کرده و بر روی یک هات‌پلیت قرار می‌گرفت هیتر هات پلیت را خاموش کرده و تنها همزن آن را روشن نگه داشته و با قرار دادن یک عدد مگنت در ظرف حاوی اسید صبر میکنیم تا با آرامی به طور کامل پودر آنترون در محلول اسید حل گردد. محلول بدست آمده را جهت مصارف بعدی در ظرف کهربایی رنگ در یخچال نگه‌داری کرده و برای اندازه‌گیری قند کل مورد استفاده قرار می‌گرفت.
ج: تهیه نمودار استاندارد قند کل :
قبل از اندازه‌گیری میزان قند کل نمونه‌ها لازم بود که منحنی استاندارد قند کل تهیه گردد. برای این منظور در شش لوله آزمایش مقادیر 0، 2، 4، 6، 8 و 10 سی‌سی از محلول گلوکز یک گرم در لیتر ریخته و با آب مقطر حجم هر لوله را به بیست میلی‌لیتر می‌رساندیم. در مرحله بعد از هر لوله آزمایش 4/0 میلی‌لیتر برداشته و با اضافه کردن شش میلی‌لیتر معرف آنترون در شش لوله آزمایش دیگر ریخته و در حمام آب گرم 100 درجه سانتیگراد قرار می‌دادیم. پس از 20 دقیقه لوله‌ها را از حمام آب گرم بیرون آوردیم و پس از خنک شدن نمونه ها در دستگاه اسپکتوفتومتر قرار داده شدند و میزان جذب نور را در طول موج 620 نانومتر قرائت و با کمک نرم‌افزار اکسل نمودار استاندارد قند کل ترسیم می‌گردید.
د: اندازه گیری قند کل:
جهت اندازه‌گیری میزان قند کل از روش مک‌کریدی و همکاران استفاده شد. در این روش به کمک دستگاه اسپکتوفتومتر و با استفاده از معرف آنترون میزان قند کل اندازه گیری می‌شود.
ه: تهیه معرف دی‌نیتروسالیسیلیک اسید :
برای تهیه 200 سی‌سی معرف دی‌نیتروسالیسیلیک اسید 2 گرم هیدروکسید سدیم را در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و سپس 1/0 گرم سولفیت سدیم به آن اضافه می‌گردید. در ظرف دیگری 2 گرم دی‌نیتروسالیسیلیک اسید را با 4/0 گرم فنل در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و به محلول اول اضافه کردیم و در نهایت حجم محلول را با کمک آب مقطربه 200 سی‌سی رسانیده و جهت اندازه‌گیری قند احیایی مورد استفاده قرار می‌گرفت.
و: تهیه نمودار استاندارد قند احیایی :
برای تهیه منحنی استاندارد قند احیایی در هشت لوله آزمایش به میزان 0، 1، 5/1، 2، 4، 6، 8 و 10 سی‌سی از محلول گلوکز یک گرم در لیتر ریخته و حجم هر لوله‌ را با آب مقطر به 15 سی‌سی می‌رساندیم. سپس در مرحله بعد 3 سی‌سی از محتویات هر یک از لوله‌ها را با 3 سی‌سی معرف دی‌نیتروسالیسیلیک اسید مخلوط کرده و به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم در دمای 90 درجه سانتیگراد قرار می‌دادیم . بلافاصله بعد از آن یک سی‌سی پتاسیم سدیم تارتارات 40 درصد به آن افزوده شد و پس از خنک شدن لوله‌ها جذب نور را در محلول ها با کمک دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 575 نانومتر را قرائت نموده و نمودار استاندارد قند احیایی به کمک نرم‌افزار اکسل ترسم گردید.
ز: اندازه گیری قند احیایی:
جهت اندازه‌گیری قند احیایی از روش میلر استفاده گردید. در این روش با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر و به کمک محلول دی‌نیتروسالیسیلیک اسید میزان قند احیایی اندازه گیری می‌شد.
ح: اندازه گیری قند غیراحیایی:
جهت اندازه گیری قند غیر احیایی از روش شاهد صدیقی و اجمل خان استفاده گردید. در این روش میزان قند غیر احیایی از تفاضل قند کل و قند احیایی محاسبه می گردد.
5- صفات مورد مطالعه:
(1)- سرعت جوانه‌زنی:
Vg= ∑Ni/Di
Vg= سرعت جوانه‌زنی بر حسب تعداد بذر در روز
Ni= تعداد بذر جوانه‌زده در هر روز
Di= شماره روز پس از جوانه‌زنی
(2)- میانگین سرعت جوانه‌زنی ( Average Velocity of Germination = AVG ):
AVG = ∑Nt/∑t
∑Nt = مجموع تعداد بذرهای جوانه‌زده در زمان t
∑t =مجموع زمان ( روز )
(3)- میانگین جوانه‌زنی در روز ( Mean of Day Germination = MDG ):
MDG =∑ (Nt/∑N)
∑Nt = مجموع تعداد بذرهای جوانه‌زده در زمان t
N∑ = تعداد بذرهای جوانه‌زده
(4)- درصد جوانه‌زنی (Germination percentage) :
GP = 100 (N’/N)
N = تعداد کل بذر
N’ = تعداد بذرهای جوانه زده
(5)- مقدار قند:
الف: مقدار قند کل:
مقدار قند کل عبارت است از مجموع میزان قند احیایی و قند غیر احیایی و همانطورکه قبلاً هم ذکر شده جهت اندازه‌گیری آن از روش مک‌کریدی و

در بذر موثر است و در بسیاری از گیاهان مانند گندم و سورگوم با افزایش تنش شوری بر مقدار قند کل افزوده می‌شود اما در برخی دیگر چون لوبیا چشم بلبلی و هندوانه سبب کاهش مقدار قند کل می‌گردد علاوه بر تأثیر ارقام گیاهی بر روی مقدار قند‌کل همانطور که در مورد گیاه برنج ذکر گردید ژنوتیپ‌ نیز در مقدار قند کل حاصله بر اثر تنش نیز موثر می‌باشد همچنین باید توجه شود که سطح تنش نیز در نحوه پاسخگویی گیاه به تنش مؤثر می‌باشد.
2-6 تأثیر شوری بر روی قندهای غیر احیایی :
در تحقیقی که بر روی جوانه‌زنی بذور گیاه سورگوم تحت شرایط تنش شوری انجام گرفته مشاهده شد که بیشترین میزان قند غیراحیایی مربوط به تیمار شاهد بوده و بجز تیمار 50 میلی‌اکیوالن بر لیتر با بالاتر رفتن غلظت نمک میزان قند غیر احیایی کاهش یافته است ( حافظ خان و همکاران، 1989). در مطالعه‌ای که بر روی دو گونه گندم انجام شد مشخص گردید که بذوری که تحت تنش شوری قرار گرفته بودند دارای میزان بیشتری قندهای غیر احیایی بودند اما واریته S-24 به نسبت واریته Inqlab دارای میزان بیشتری از قندهای غیر احیایی بود ( حمید و همکاران، 2008 ). در گیاه برنج مشاهده شده است که واریته ‌های مختلف از یک گیاه از نظر میزان قندهای غیر احیایی پاسخ‌های متفاوتی را نسبت به تنش شوری از خود نشان می‌دهند و به طور کلی در هر دو واریته Indrayani و Ambemohar با بالا رفتن میزان شوری میزان قندهای غیراحیای افزایش یافت ( دانی تامب حالی و همکاران، 2011 ). تفاوت میزان قندهای احیایی در بین واریته‌های مختلف یک گونه در گیاهان دیگر نیز مشاهده شده است به عنوان مثال در گیاه Halopyrum mucronatum L. در بین دو واریته بذر قهوه‌ای و بذر سیاه آن مشخص شد که میزان کل قند غیر احیایی در بذور قهوه‌ای نسبت به بذور سیاه بیشتر بود اما در زمان‌های 4 و 48 ساعت پس از شروع جوانه زنی تفاوت قابل توجهی با هم نداشتند ( شاهد صدیقی و اجمل‌خان، 2010). در مطالعه‌ای دیگر که بر روی بذور گیاه پنبه تحت شرایط تنش شوری انجام شد مشخص گردید که سطوح قندهای احیایی و غیر احیایی با گذشت زمان بتدریج زیاد می‌شود اما غلظت قندها با افزایش غلظت نمک کاهش می‌یابد و بطور کلی در کلیه واریته‌های مطالعه شده در این تحقیق میزان قندهای غیر احیایی از قندهای احیایی در سیدلینگ‌ها در کلیه سطوح شوری بعد از 72 ساعت بیشتر بوده است ( یاسین اشرف و همکاران، 2002 ). همانگونه که در مورد قندکل نیز بیان شد در مورد قندهای غیراحیایی نیز باید ذکر گردد که مقدار قندهای غیراحیایی که بر اثر تنش در گیاه تولید می‌شود با توجه به نوع گیاه متغیر می‌باشد حتی این تغییرات در سطح واریته‌های مختلف نیز مشاهده می‌گردد همچنین تغییر در مقدار قندهای غیراحیایی بر اثر تنش شوری به سطح تنش شوری وابسطه می‌باشد.
2-7 تـأثیر شوری بر روی قندهای احیایی:
در مطالعه‌ای که برروی بذور گیاه سورگوم تحت تنش شوری انجام شد مشاهده گردید که در بذور تحت تنش دارای میزان بالاتری قند‌های احیای بودند و از زمان 0 تا 14 ساعت این میزان در حال افزایش بود (کاور گیل و همکاران، 2002). بر طبق گزارش حافظ خان و همکاران تأثیر تنش شوری بر روی بذور سورگوم سبب گشت که بجز تیمار 50 میلی اکیوالان بر لیتر با بالا رفتن میزان شوری از میزان قند های احیایی کاسته شود و بالاترین میزان قند در تیمار شاهد مشاهده گردید ( حافظ‌خان و همکاران، 1989 ). در مطالعه‌ای دیگر که بر روی بذور سورگوم انجام شده مشاهده گردید که بذور این گیاه که در معرض تنش شوری قرار گرفته بودند افزایش قابل ملاحظه‌ای را در میزان قندهای احیایی از خود نشان دادند ( کاور گیل و همکاران، 2001). مشاهده شده است که میزان قندهای احیایی در گوجه فرنگی بر اثر تنش شوری در جهت سازگار شدن با محیط افزایش پیدا کرده است ( هاندا و همکاران، 1983 ). حمید و همکاران گزارش نمودند که بذور دو واریته گندم که تحت تنش شوری قرار گرفته بودند در هر دو واریته میزان قندهای احیایی افزایش یافت اما در بین این دو واریته افزایش میزان قندهای احیایی در واریته S-24 بیشتر از واریته Inqlab بود ( حمید و همکاران، 2008 ). در مطالعه‌ای دیگر که بر روی بذور گیاه پنبه تحت شرایط تنش شوری انجام شد مشخص گردید که سطوح قندهای احیایی و غیر احیایی با گذشت زمان بتدریج زیاد می‌شود اما غلظت قندها با افزایش غلظت نمک کاهش می‌یابد در کلیه واریته‌های مطالعه شده در این تحقیق میزان قندهای غیر احیایی از قندهای احیایی در سیدلینگ‌ها در کلیه سطوح شوری بعد از 72 ساعت بیشتر بود (یاسین اشرف و همکاران، 2002 ). در تحقیقی که بر روی بذور دو گونه از گیاه Halopyrum mucronatum L. انجام شد مشاهده گردید که میزان قندهای احیایی در بذور مشکی بعد از 12 ساعت که بذور در معرض 100 و 200 میلی مول نمک طعام قرار گرفتند بالاتر بود اما به طور کلی میزان کل قندهای احیایی در هر دو گونه بذر قوه‌ای و بذر مشکی داراری روندی مشابه بوده و مشاهده گشت که با گذشت زمان تا 12 ساعت به میزان اپتیمم خود رسید و بعد از آن با جلو رفتن زمان کاهش یافت ( شاهد صدیقی و اجمل خان، 2011). در مطالعه‌ای که بر روی گیاه بامیه انجام شده مشاهده گردید که میزان قندهای احیایی در بذور در معرض تنش در این گیاه با بالا رفتن میزان شوری زیاد می شود ( بسما و منیر، 2010 ). همانگونه که در مورد قندکل و قندهای غیراحیایی نیز بیان شد در مورد قندهای احیایی نیز باید ذکر گردد که مقدار قندهای احیایی که بر اثر تنش در گیاه تولید می‌شود با توجه به نوع گیاه متغیر می‌باشد حتی این تغییرات در سطح واریته‌های مختلف نیز مشاهده می‌گردد همچنین تغییر در مقدار قندهای احیایی بر اثر تنش شوری به سطح تنش شوری نیز وابسطه می‌باشد.
2-8 تأثیر پرایمینگ جیبرلیک اسید بر میزان قند :
حمیدا و شدداد گزارش کردند که جیبرلیک اسید به طور کلی سبب افزیش میزان کربوهیدرات محلول در طی تنش شوری در سیدلینگ‌ها می‌شود ( حمیدا و شدداد، 2010). هوبر و همکاران گزارش کردند که کاربرد جیبرلیک اسید باعث خنثی شدن تأثیرات منفی کلرید سدیم در برگهای گیاه Pennisetum typhides می‌شود ( هوبر و همکاران، 1974 ). بر طبق گزارشی دیگر اضافه کردن جیبرلیک اسید خارجی سبب افزایش جوانه‌زنی و رویش سیدلینگ ها شده که این موضوع خود ناشی از بالا رفتن میزان دسترسی به جیبرلیک اسید درونی است ( کاوور و همکاران، 1998 ). در مطالعه‌ای دیگر که بر روی جوانه زنی برنج تحت شرایط تنش شوری انجام شده است میزان کل قندهای محلول در اندوسپرم بذور جوانه زده برنج که در معرض تنش شوری بودند در طی دوره جوانه‌زنی اندکی افزایش یافت در صورتی که در بذور تیمار شده بوسیله جیبرلیک اسید در طی جوانه‌زنی میزان قند کل به صورت خطی زیاد گردید. در مورد تغییر در میزان قندهای احیایی باید گفته شود که این تغییرات بسیار شبیه با تغییرات در میزان قند کل در این بذور می‌باشد ( کیم و همکاران، 2006 ). همانطور که در مورد تأثیر جیبرلیک‌اسید پرایمینگ در بخش 2-4 بیان شده بود تأثیرات آن در گیاهان مختلف متفاوت می‌باشد. می‌توان انتظار داشت که در مورد میزان قند نیز این موضوع صادق باشد.
2-9 تأثیر پرایمینگ سالیسیلیک اسید بر میزان قند :
در مطالعه‌ای که بر روی جوانه زنی بذور خیار تحت شرایط تنش شوری انجام شد مشخص گردید که تیمار این بذور به کمک سالیسیلیک اسید سبب افزایش میزان قند کل و همچنین قندهای احیایی در سیدلینگ‌های این گیاه می‌شود. همچنین سالیسیلیک اسید سبب تجمع قابل توجه قندهای محلول در برگها و ریشه‌های این گیاه می‌گردد ( دونگ و همکاران، 2011 ). در این فعل و انفعالات آمیلاز سبب شکستن قندهای پیچیده به قندهای ساده می‌شود و به عنوان مثال می‌توان به شکسته شدن نشاسته به قندهای ساده‌ای چون مالتوز اشاره کرد. در بذور گندم کاربرد سالیسیلیک اسید سبب افزایش آمیلاز می‌گردد و همچنین موجب جلوگیری از بازدارندگی آبسزیک اسید بر روی فعالیت آمیلاز می‌شود ( شاشی و همکاران، 1986 ). در مطالعه‌ای که بر روی دو واریته گندم تحت تنش شوری انجام شد مشخص گردید که کاربرد سالیسیلیک اسید بر روی این بذور تحت شرایط تنش سبب می‌شود که میزان قند کل در هر دو واریته افزایش یابد در ادامه کاربرد سالیسیلیک اسید تأثیر قابل توجهی نیز بر روی قندهای احیایی داشته و سبب می‌شود که در هر دو واریته میزان قندهای احیایی افزایش یابد. همچنین مشخص شد که استفاده از سالیسیلیک اسید تحت شرایط تنش شوری سبب افزایش میزان قندهای غیر احیایی نیز می شود ( حمید و همکاران، 2008 ). در تحقیقی که بر روی گیاه Savia officianlis L. انجام شد مشاهده گردید که بر اثر وقوع تنش شوری میزان قند در برگهای این گیاه افزایش یافت که کاربرد سالیسیلیک اسید موجب افزایش بیشتر میزان قند در برگها گردید ( خسروی و همکاران، 2011 ). کاربرد سالیسیلیک اسید می‌تواند سبب فعال شدن زوال متابولیسم قندهای محلول بر اثر افزایش فشار اسمزی شود . تصور می‌شود که تیمار سالیسیلیک اسید سبب اختلال در سیستم هیدرولیز پلی ساکاریدها می شود ( خوداری، 2004 ). در مطالعه‌ای که بر روی گیاه ذرت صورت گرفت مشاهده شد که تنش شوری سبب افزایش میزان قابل توجه‌ای قند در برگهای این گیاه گردیده و همچنین دیده شد که سالیسیلیک اسید سبب افزایش بیشتر میزان قند نسبت به بذور تیمار نشده تحت شرایط تنش گردد ( فهد و بانو، 2012 ). گمس و همکاران گزارش کردند که کاربرد سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان قندهای محلول در گیاه گوجه فرنگی تحت شرایط تنش شوری می‌گردد ( گمس و همکاران، 2008 ). با توجه به مطالب ذکر شده می‌توان بیان کرد که کاربرد پرایمینگ سالیسیلیک اسید بر روی مقدار قندها در بذر موثر بوده همچنین انتظار می‌رود نحوه و میزان این تأثیر با توجه به غلظت مورد استفاده همچنین نوع و ورایته گیاه تغییر کند.
2-10 تأثیرهیدروپرایمینگ ( آب پیش تیمار سازی ) بر میزان قند :
ثابت شده است که تیمار هیدروپرایمینگ بذر در افزایش جوانه زنی و شاخص‌های بیوشیمیایی بذر بسیار موثر است ( نوربخشیان و همکاران، 2011 ). هیدروپرایمینگ موجب برخی تغییرات فیزیولوژیک شامل میزان قند و ترکیبات ارگانیک و انباشت یون‌ها در بذر، ریشه و در نهایت در برگ‌های گیاه و موجب بالا رفتن جوانه‌زنی و مقاومت بیشتر به شرایط بد محیطی می‌شود ( آلواردو و همکاران، 1987 ). در مطالعه‌ای که بر روی دو واریته گیاه ذرت انجام شد مشاهده شد که تغییرات کربوهیدرات‌های محلول از پرایمینگ در هر دو رقم مشابه بوده و هیچ‌گونه تغییر قابل توجهی در میزان گلوکز در دو رقم بذر مشاهده نشد هرچند که میزان گلوکز در رقم PC بیشتر از رقم NCSRC بود. در مورد قندهای محلول آغازین محتوای رافینوز در بذور پرایم نشده PC به طور قابل توجهی بالاتر بود اما در موردجوانه‌زنی بعد از تسریع کهنه شدن بذر میزان جوانه زنی کمتر از NCSRC بود ( واتاناکولپاکین و همکاران، 2012 ). گزارش شده است که یک رابطه معنی دار بین کاهش ساکاروز و رافینوز در بذور هیدروپرایم شده کاهو با کاهش ویگور وجود دارد. ساکاروز همچنین ممکن است که موجب پایداری غشاء گردد چون دارای توانایی خوبی جهت ساختن باندهای هیدروژنی با اجزاء غشاء دارد ( ولکر و همکاران، 1998 a و b). در تحقیقی که بر روی گیاه اسپرس انجام شده مشاهده شده است که هیدروپرایمینگ به طور قابل ملاحظه‌ای سبب افزایش فعالیت آلفا آمیلاز ، میزان قند کل و قندهای احیایی و همچنین سبب کاهش میزان قندهای غیر احیایی می‌شود ( نوربخشیان و همکاران، 2011). بر طبق گزارشی دیگر بذور هیدروپرایم شده برنج رقم فاین دارای میزان بالاتری

افضل و همکاران انجام شد مشخص گردید که تیمار هیدروپرایمینگ در هر دو حالت نرمال و تنش شوری سبب افزایش درصد جوانه‌زنی، متوسط زمان جوانه‌زنی در بذور گندم می‌گردد (افضل و همکاران،2007). کاسیریو و همکاران بیان نمودند که هیدرو پرایمینگ بهترین روش برای جوانه زنی بذور پیاز می‌باشد ( کاسیریو و همکاران، 2004)و مشاهده گردید که یافته‌های آنان با تحقیقات کایا و همکاران ( کایا و همکاران، 2004) و همچنین تحقیقات باسرا و همکاران مطابقت دارد. طبق گزارش باسرا و همکاران بذور هیدروپرایم شده آفتابگردان و گندم توانایی جوانه‌زنی سریعتر را تحت شرایط تنش شوری را دارا می‌باشند ( باسرا و همکاران، 2006). در تحقیقی دیگر که برروی گیاه شنبلیله انجام شد مشخص گردید که هیدرو پرایمینگ در دو حالت نرمال و تنش سبب افزایش میزان جوانه زنی و متوسط زمان جوانه‌زنی می‌شود و بعلاوه بر اثر هیدروپرایمینگ میزان جوانه‌زنی نرمال افزایش می یابد ( علی‌آبادی فراهانی و معروفی، 2011). نتایج بدست آمده از این تحقیق با تحقیقات تورنتون و پاول که بر روی گل کلم و همچنین تحقیقات سرینیواسان و همکاران که بر روی بذور خردل مطالعه کرده بودند مطابقت داشت(تورنتون و پاول، 1992) (سرینیواسان و همکاران، 1999). در گزارشی دیگر مشخص شد که هیدروپرایمینگ بر روی جوانه‌زنی گیاه ریحان تحت شرایط تنش شوری دارای تأثیر مثبت بوده و سبب افزایش درصد جوانه‌زنی و میزان ویگور در بذور این گیاه می شود ( علی‌آبادی فراهانی و معروفی، 2011). در مطالعه‌ای که بر روی گیاه کنجد انجام شد مشخص گردید که تیمار هیدرو پرایمینگ در شرایط تنش شوری بر روی درصد جوانه زنی و زمان رسیدن به 50 درصد جوانه زنی موثر بود ( فردول و همکاران، 1390). بر طبق گزارشی دیگرتیمار هیدروپرایمینگ بر روی زیره سبز در هر دو حالت تنش و نرمال سبب بهبود میزان جوانه‌زنی و متوسط زمان جوانه زنی شد و همچنین این تیمار سبب افزایش جوانه‌زنی نرمال گردید ( نعمت‌الهی و همکاران، 2009). افضل و همکاران گزارش نمودند که در گیاه برنج شوری سبب کاهشی قابل توجه در جوانه زنی و رشد سیدلینگ‌ها گردید. وی همچنین بیان نمود که تیمار هیدروپرایمینگ سبب بهبود جوانه‌زنی و خصوصیات وابسته به آن از جمله درصد نهایی جوانه‌زنی، متوسط زمان جوانه‌زنی و زمان رسیدن به 50 درصد جوانه‌زنی در مقابل بذور پرایم نشده گردید ( افضل و همکاران، 2012). در تحقیقی دیگر که توسط شفیع زاده و همکاران بر روی گیاه گل گاوزبان انجام شد مشخص گردید که هیدروپرایمینگ بر روی درصد جوانه‌زنی، سرعت جوانه زنی، و بنیه بذر دارای تأثیر معنی داری بوده است. در تمامی تیمارها با افزایش سطوح شوری درصد جوانه‌زنی کاهش یافته است ولی در سطوح شوری پائین بذرهای تمیار شده نسبت به بذرهای شاهد درصد جوانه‌زنی بیشتری داشتند ( شفیع‌زاده و همکاران، 1389). در مطالعه‌ای که بر روی گیاه کلزا انجام شده مشخص گردید که هیدروپرایمینگ بذور کلزا در شرایط تنش شوری سبب کاهش زمان جوانه‌زنی می‌گردد. همچنین مشخص گردید که این تیمار بخصوص در شرایط پتانسیل اسمزی پایین سبب تسریع جوانه زنی می‌شود ( امیدی و همکاران، 2009). در گزارشی دیگر که بیان‌گر نتیجه مشابهی با تحقیقات امیدی و همکاران می‌باشد دهارمالینگام و باسو بیان نمودند که خیساندن و سپس خشک کردن بذر کلزا سبب افزایش جوانه زنی در این گیاه می‌گردد (دهارمالینگام و باسو، 1990). خدا بخش و همکاران گزارش نمودند که در گیاه نخود هیدروپرایمینگ در زمان تنش شوری سبب بهبود سرعت و درصد جوانه‌زنی می‌شود ( خدابخش و همکاران، 1389). بر خلاف نتایج فوق در تحقیقی که بر روی گیاه یونجه انجام شده مشخص گردید که هیدرو پرایمینگ در شرایط تنش شوری بر روی درصد جوانه‌زنی تأثیر ندارد ( جرجندی و شریفی سیرچی، 2012). در تحقیقی دیگر که برروی گیاه Suaeda salsa انجام گرفت مشخص شد که به طور کلی درصد جوانه‌زنی با بالا رفتن غلظت نمک طعام کاهش می‌یابد اما در غلظتهای پایین تأثیر منفی قابل توجهی بر روی جوانه‌زنی ندارد. در این آزمایش از چندین ماده مختلف جهت پرایمینگ استفاده شده بود که در مورد درصد جوانه زنی کمترین میزان جوانه‌زنی زمانی مشاهده شد که جهت پرایمینگ از آب خالص استفاده شده بود. در مورد میزان جوانه‌زنی این میزان با استفاده از آب خالص حتی از میزان جوانه زنی شاهد نیز کمتر شد ( سونگ و همکاران، 2012). در نهایت باید ذکر گردد که هیدروپرایمینگ بر روی بذور برخی گیاهان سبب افزایش بعضی شاخص‌های جوانه‌زنی هم در حالت تنش و هم در حالت نرمال می‌شود که می‌توان به گیاهان گندم، آفتابگردان، شنبلیله و زیره اشاره کرد. در مورد گیاه ماریتیغال این تیمار سبب افزایش درصد جوانه زنی گردید اما در گیاه یونجه بی‌تأثیر بوده و در گیاه Suada salsa دارای تأثیر منفی بوده است و در کل می‌توان نتیجه گیری کرد که تأثیرات این پرایمینگ نیز مانند سالیسیلیک اسید پرایمینگ وابسته به نوع گونه بوده و همچنین باید در نظر گرفته شود که مدت زمان پرایمینگ نیز همانند غلظت در سالیسیلیک اسید پرایمینگ می‌تواند فاکتور مهمی در جهت تأثیرات این نوع پرایمینگ باشد.
2-3 پیش تیمار سازی با نمک(هالو پرایمینگ):
پیش‌تیمار سازی با نمک می‌تواند روش خوبی برای ایجاد مقاومت در بذور نسبت به شوری باشد ( افکاری باجه باج، 2009) و به بیان دیگر می‌توان گفت که پیش‌تیمار سازی با نمک روش مناسبی جهت سازگاری بذر با تنش شوری می باشد (وایب و مهی‌الدین، 1987) (کانو و همکاران، 1991) ( کایوالا و همکاران، 1996). مشاهده شده است که در گیاهان طالبی ( کواریرتو و همکاران2006) (جامسون و همکاران، 1997) و گوجه فرنگی (سیورتیپسو همکاران، 2003) پیش تیمار سازی با نمک باعث بهبود جوانه‌زنی، رشد سیدلینگ‌ها و رویش گیاه گردیده است. همچنین در گیاه کلزا علاوه بر درصد نهایی جوانه زنی بر روی متوسط مدت زمان جوانه زنی و وزن خشک نیز دارای تأثیر مثبت داشته است ( فرهودی و شریف‌زاده، 2006). در گزارشی دیگر بیان شده است که پرایمینگ بوسیله نمک طعام در گیاه کلزا باعث افزایش شاخص جوانه زنی و درصد نهایی جوانه زنی شده است. شوری سبب کاهش درصد نهایی جوانه زنی و شاخص جوانه زنی در دو گروه بذور پرایم شده و پرایم نشده گردید که این کاهش در بذور پرایم نشده با افزایش میزان شوری با شدت بیشتری بود ( عبدالهی و جعفری، 2012). شکاری و همکاران نیز گزارش نمودند که پرایمینگ به وسیله نمک در کیاه کلزا منجر به افزایش سرعت و درصد جوانه زنی گردید ( شکاری و همکاران، 2000). در تحقیقی دیگر که بر روی گیاه کلزا انجام گردیده بود نتایج مشابهی در مورد میزان جوانه‌زنی و درصد جوانه زنی گزارش گردید( محمدی، 2009). در مورد خربزه رقم تخم قند گزارش شده که پیش‌تیمار سازی بوسیله نمک سبب افزایش میزان کربوهیدرات گردیده است ( فرهودی و همکاران، 2011). نتایج مشابهی در مورد تأثیر مثبت پرایمینگ در مورد گیاه طالبی گزارش شده است. در این تحقیق گزارش شده است که در شوری 5/1 درصد بذور این گیاه قادر به جوانه زنی نبودند در حالی که درصد جوانه زنی در بذور پرایم شده به 45 درصد می رسید (سیوریتیپ و همکاران، 2003). همچنین در گیاه طالبی نیز پیش‌تیمار سازی بوسیله نمک سبب افزایش میزان کربوهیدرات ‌های محلول گردید و در نتیجه مقاوت گیاه نسبت به تنش شوری بهبود یافت (سیوریتیپ و همکاران، 2003). تغیرات فیزیولوژیکی ناشی از پیش‌تیمارسازی با نمک به ندرت مورد مطالعه قرار گرفته‌اند ( کایولا و همکاران، 1996). در گزارش دیگری آمده است که پیل با انجام آزمایشی روی آسپراگوس و گوجه فرنگی ( پیل، 1991) و از سوی دیگر پسام و کاکوریوتیس بر روی گیاه خیار چنین نتیجه گرفتند که پیش تیمار باعث بهبود جوانه زنی بذرها و ظهور گیاه‌چه ورشد تحت شرایط تنش شوری می‌شود ( پسام و کاکوریوتیس، 1994). همچنین اسماعیل‌پور و همکاران گزارش کردند که پرایمینگ بذر به کمک نمک طعام در بذور گیاه خیار سبب افزایش درصد نهایی جوانه‌زنی و میزان جوانه زنی در این گیاه می‌شود ( اسماعیل‌پور و همکاران، 2006). در مورد گیاه آفتابگردان مشاهده شد که بذور پیش‌تیمار سازی شده با نمک و بذوری که پیش تیمار سازی نشده بودند، هر دو گروه بر اثر افزایش شوری کاهشی را در درصد جوانه‌زنی نشان دادند که این موضوع در گیاهان پیش‌تیمار سازی نشده بیشتر بوده است (افکاری باجه‌باج، 2009). بذرهای تیمار شده دارای کارایی بهتری در زمینه جذب آب در محیط رشد می‌باشند چون مشخص است که فعالیت‌های متابولیک در بذر در حین جوانه‌زنی قبل از زمانی آغاز می‌شود که ریشه‌چه و ساقه چه ظاهر شود (هوپر و همکاران، 1979). به طور کلی می‌توان نتیجه گرفت که توانایی بالاتر در مقاومت نسبت به شوری در گیاهانی که از بذور پرایم شده به وسیله نمک تولید شده بودند ناشی از توانایی بالاتر این گیاهان در تنظیم اسمزی است که این موضوع ناشی از آن است که این گیاهان دارای میزان بیشتری یون Na+ و Cl- در ریشه ها و میزان بیشتری قند و مواد آلی در برگها نسبت به گیاهانی که از بذور پرایم نشده بدست آمده‌اند، می‌باشند ( فرهودی و شریف‌زاده، 2006). در تحقیقی دیگر که بر روی بذرو گیاه ماریتیغال انجام گرفته است مشخص گردیده است که پرایمینگ به وسیله نمک طعام باعث بهبود جوانه زنی در این گیاه می‌شود هرچند که پرایمینگ باعث افزایش درصد جوانه زنی در این گیاه گردید اما این افزایش در سطوح پایین‌تر شوری بیشتر بود و جوانه زنی در بذور پرایم شده به نسبت بذور شاهد سریعتر روی می داد ( صدقی و همکاران، 2010). در مورد گیاه برنج شوری باعث کاهش جوانه زنی می‌گردد اما پرایمینگ نمک سبب بهبود جوانه زنی و خصوصیات وابسته به آن می‌شود که به عنوان مثال می‌توان به درصد نهایی جوانه‌زنی، متوسط زمان جوانه‌زنی و همچنین زمان رسیدن به 50 درصد جوانه‌زنی اشاره کرد (افضل و همکاران، 2012). گزارش شده است که پرایمینگ با نمک طعام در سطوح مختلف شوری بر روی عملکرد فلفل تند موثر است این نتایج حاکی از آن بودند که درصد نهایی جوانه‌زنی بر اثر شوری کاهش می‌یابد که این موضوع با افزایش میزان شوری شدیدتر می‌شود و این در حالی است که پرایمینگ سبب کاهش اثرات مخرب شوری می‌گردد. همچنین مشاهده شده که پرایمینگ باعث کاهش زمان مورد نیاز جهت جوانه‌زنی و بهبود شاخص ظهور جوانه گردیده است ( خان و همکاران، 2009). بهبود جوانه زنی توسط پرایمینگ نمک طعام همچنین توسط اسمیت و کوب نیز گزارش شده است ( اسمیت و کوب، 1991). در تحقیقی که در پاکستان بر روی چند واریته گندم صورت گرفت مشخص شد که درصد جوانه‌زنی بر اثر افزایش شوری به شدت کاهش یافت ولی با انجام عمل پرایمینگ افزایش زیادی در درصد جوانه‌زنی بذور پرایم شده نسبت به بذور پرایم نشده مشاهده گردید ( جمال و همکاران، 2012). در تأ
یید تأثیر مثبت پرایمینگ نمک طعام بر روی گیاه گندم اقبال و همکاران بیان کردند که این تیمار روشی موثردر کاهش اثرات سو تنش شوری بر روی گندم می‌باشد ( اقبال و همکاران، 2006). ابرو و همکاران نیز گزارش مشابهی را در این زمینه نمودند و همچنین اضافه کردند که پرایمینگ به کمک نمک سبب کاهش تعداد روزهای جوانه‌زنی می‌شود ( ابرو و همکاران، 2009). تحقیقات نشان داده که پیش تیمار نمک طعام بر روی ذرت واریته 704 درصد سبز شدن با افزایش شوری در هر دو شرایط پیش‌تیمار و عدم پیش‌تیمار کاهش یافت اما پرایمینگ بذرها سبب افزایش درصد جوانه‌زنی آنها تحت شرایط تنش گردید. پیش تیمار کردن بذرها توانست تا حد زیادی میانگین مدت سبز شدن را در شرایط شوری حفظ کرده و مانع از افزایش آن در شرایط تنش شوری شود ( سالاری و همکاران، 1387). در گزارشی دیگر در مورد دو گونه