با دومین های protein متصل به z-f مشاهده شده است. اثرات مختلفی از جمله جابجایی z-f، تشکیل کمپلکس های ترکیبی، اکسیداسیون رزیدوهای سیتئین در دومین های متصل به فلز مشاهده شده است. تاخوردن نامناسب دومین های z-f با فقدان عملکرد درست protein همراه است. مختل شدن ساختارهای z-f ممکن است منجر به تداخل در پروسه های متعدد سلولی درگیر در بیان ژن، تنظیم رشد و حفاظت یکپارچه ژنومیک شود. همچنین این فلزات از طریق اثر بر روی فعالیت XPA و Fgp، دو پروتئین z-f موثر در ترمیم DNA باعث مهار ترمیم حذف نوکلئوتید و مهار ترمیم حذف باز می شوند (105).
2-8-3- نیکل
– یکی از مکانیسم های احتمالی آپوپتوز و سرطان های ناشی از نیکل، القاء ROS توسط ترکیبات نیکل است. ROS تولید شده در مسیرهای سیگنالینگ Akt (پروتئین کیناز B) درگیر است (شکل 25).
Akt سرین/تره اونین کینازها، یکی از تنظیم کننده های اصلی عمل زنده ماندن سلول در پاسخ به تحریک فاکتور رشد است. اعتقاد عمومی بر این است که این کینازها از طریق فسفوریلاسیون و مهار تعدادی از پروتئین های تنظیم کننده آپتوز، ضد آپپتوز هستند. گزارش شده است که کیناز 1 تنظیم کننده سیگنال آپپتوز (ASK1) توسط Akt در سرین 83 فسفریله می شود و فعالیتش کاهش می یابد.
ASK1، یک سرین تره اونین کیناز است که به عنوان یک پروتئین کیناز کیناز کیناز فعال کننده میتوژن (MAPKKK)، در پروتئین کیناز c-Jun N-terminal kinase/stress-activated (JNK/SAPK) و آبشارهای سیگنالینگ p38 MAPK در ابتدا کشف شد. امروزه، تحقیقات اصلی بر Akt، بر نقش آن در پیشرفت رشد سلول فوکوس کرده است. در مورد عملکردش در آپپتوز سلولی شناخت کمی وجود دارد. مطالعات اخیر خاطر نشان کرد که نیکل القاء کننده ROS، Akt را فعال می کند، که از طریق فسفوریلاسیون Thr838، سبب فعال شدن ASK1 می شود که منجر به فعالیت پایین دست p38 MAPK شده و سرانجام سبب آپپتوز سلولی می شود(107-106).
شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ.
– نیکل در انسان و حیوان یک سرطانزا می باشد که اثر اولیه شروع پروسه اش در گسترش سرطان ریه است. فلزات واسطه می توانند به DNA از طریق رادیکال های آزاد تولید شده توسط واکنش فنتون، آسیب برسانند.
پروتئین های انگشت روی به عنوان عوامل رونویسی ای که به طور خاص به توالی های کوتاه DNA متصل شده اند و کنترل رونویسی از تعدادی ژن را به عهده دارند، عمل می کنند.
آزمایشات نشان داده اند که فلزات مانند کبالت، کادمیم، مس، نیکل و آهن ممکن است به جای روی، در پروتئین انگشت روی جایگزین شوند. یک مکانیزم مهم سرطانزایی این فلز واسطه، افزایش پردازش اکسیداسیون احیاء سلولی توسط فلزات است. با جایگزینی اکسیداسیون احیای فلز به جای روی در پروتئین انگشت روی، انتظار تولید رادیکالهای آزاد است که ممکن است باعث تخریب DNA شود(109-108).
– اثر خارج سلولی نیکل که ممکن است در سرطانزایی آن نقش داشته باشد، تغییر در اتصال نرمال DNA-pr است. از آنجایی که تنظیم همانندسازی DNA و بیان ژن به تعاملات DNA-pr بستگی دارد، اثر نیکل در تغییر وسیع اتصال DNA-pr، ممکن است در تنظیم مداخله کند و منجر به فعالیت سرطانزایی ترکیبات نیکل شود(110).
– فعالیت پایدار NF-kB بوسیله مسیرهای سیگنالینگ فعال شده توسط فلز، می تواند منجر به فرآیندهای التهابی مزمن و بیماری های مرتبط، از جمله سرطان شود. تولید TNF-a, IL-1 B, IL-6 و IL-8 به علت نقش مهم آنها در بیماریهای التهابی مزمن و بیماریهای اتوایمیون افزایش پیدا کرد و سرانجام سبب توسعه سرطان شد. نتایج به دست آمده نشان داد که روی، نیکل و کادمیوم به میزان قابل توجهی NF-kB را فعال می کنند و کموکین IL-8 را انتشار می دهند (111).
– نیکل از طریق مسیرهای سیگنالینگ مختلف موجب بیان CCR7 (رسپتور کموکاین) در سلولهای دندرتیک انسان می شود. نیکل مستقیما بیان CCR7 را از طریق P38 MAPK و فعالیت JNK، فعال می کند(112).
– مطالعات نشان داد که، بیان پروتئین c-Myc بوسیله یونهای نیکل درسلولهای اپیتلیال نایژه ای انسان غیر توموری(Beas-2B) و سلولهای کراتینوسایت T افزایش می یابد. مطالعات همچنین نشان داد که یونهای نیکل در سلولهای Beas-2B سبب القاء آپپتوز می شوند. از بین بردن c-Myc در سیستم سلولی موش، اهمیت نقش c-Mycرا در آپپتوزهای القاء شده توسط یون فلز نشان داد. یون نیکل c-Myc موجود در Beas-2B را از طریق مسیر MEK/ERK تنظیم می کند. در مجموع، نتایج نشان می دهد که القاء c-Myc طراحی شده توسط یون نیکل از طریق یک مسیر وابسته به ERK رخ می دهد و نقش بسیار مهمی در آپپتوز ناشی از نیکل در سلولهای Beas-2B دارد(113).
2-8-4- آلومینیوم
– به صورت مزمن در معرض آلومینیوم بودن، به طور قابل توجهی میزان فعالیت PKC و MAPK را کاهش می دهد و میزان بیان ERK1/2 و CaMKII را در هیپوکامپوس کم می کند، LTP ناحیه CA1 هیپوکامپال، سبب ترمیم تواناییهای حافظه در موش ها می شود(114).
– با استفاده از سلول های سالم تحریک شده توسط فلوراید، آلومینیوم سبب کاهش تشکیل اینوزیتول فسفات به صورت وابسته به دوز می شود. در سلول های digitonin permeabilized، تحریک با GTP غیر قابل هیدرولیز، تشکیل فسفات اینوزیتول نیز با افزایش دوز آلومینیوم مهار شد. مانند مسیر حدواسط Ca+2، آلومینیوم باعث کاهش آزاد شدن IP3 می شود. در نتیجه آلومینیوم به عنوان یک عنصر اساسی برای انتقال سیگنال همراه فسفواینوزیتید، عمل می کند(115).
– آبشار سیگنالینگ فسفولیپید(شکل 26) یک سیستم اصلی در ترانسداکشن سلولی است و با سایر مکانیسم های سیگنال ترانسداکشن قرابت دارد. این آبشار شامل تعامل بین تولید پیامبرهای ثانویه و پروتئین های مختلف مانند کانالهای یونی، پروتئینهای کینازی و پروتئینهای سیگنالینگ است. نتیجه این تعامل ها می تواند متابولیسم را تغییر دهد. فسفاتیدیک اسید(PA) در آبشارهای سیگنالینگ و همچنین در بیوسنتز فسفولیپید پیشگام است. طبق تحقیقات، آلومینیوم اثرات مهاری بر روی PA در نتیجه بر روی سیگنالینگ فسفولیپید دارد. مهمترین مسیرهای تشکیل PA در سیگنالینگ گیاهان، فسفولیپاز C (PLC)، دی اسیل گلیسرول کیناز (DGK) و فسفولیپاز D (PLD) است. تاثیر Al بیشتر بر روی مسیر PLC/DGK می باشد(116).
شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید.
2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها
داشتن اطلاعات درباره جزئیات ساختمان سه بعدی یک پروتئین برای توسعه درک عملکرد آن ضروری است. متاسفانه در مقایسه با تعداد بسیار زیاد توالی های شناخته شده، ساختمان تعداد کمی از پروتئینها شناخته شده است. با رشد بیشتر شکاف بین توالی ها و ساختمان های شناخته شده، نیاز به توسعه روشهای پیشگویی ساختمان که قابل اعتماد باشند افزایش یافته ‌است، بویژه برای پروتئینهایی که تعیین ساختمان آنها به طریق تجربی ممکن نباشد و پروتئینی با توالی مشابه با آن که ساختمانش شناخته شده باشد نیز یافت نشود. بعلاوه روشهای پیشگویی موفق، به روشن شدن رابطه بین توالی اسیدهای آمینه و ساختمان پروتئین ها کمک میکند و میتواند به طراحی پروتئینهای جدید و مهندسی آنها کمک کند.
2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها
ساختارهای اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین ها را می توان با روشهای بیوانفورماتیک بدست آورد. ساختار دوم با روش CD و FTIRو ساختار سوم با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، می تواند مشخص شود(117).
2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها
اغلب پروتئین ها دارای توالی متشکل از ترکیب بیست نوع ال-اسیدآمینه که در طبیعت یافت می شوند هستند. در این بین تنها سه اسید آمینه ی ضروری تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین (شکل27)، قادر به جذب انرژی فرابنفش در طیف الکترومغناطیسی می باشند و تا حد زیادی خواص منحصر به فرد اسپکترال پروتئین ها به این سه اسید آمینه نسبت داده شده است. این سه اسیدآمینه طول موج جذب و نشر متفاوتی دارند. تریپتوفان نسبت به تیروزین و فنیل آلانین خاصیت فلوئورسانس بیشتری دارد (جدول2)، هرچند خواص فلوئورسانس تریپتوفان وابسته به محیط می باشد. به عنوان مثال زمانیکه قطبیت محلول کاهش پیدا می کند متعاقب آن طیف فلوئورسانس به سمت طول موج کوتاهتر شیفت می یابد و شدت نشر فلوئورسانس هم افزایش می یابد. این به این دلیل است که ریشه های تریپتوفان بیشتر داخل نواحی هیدروفوبیک پروتئین می شود و موجب ایجاد یک شیفت در طیف نشری می گردند. این پدیده در مطالعات دناتوراسیون پروتئین ها استفاده می شود (118). بنابراین بر حسب تعداد این سه اسید آمینه و نیز محل قرار گیری آن ها در یک پروتئین، این سه اسید آمینه می توانند اطلاعاتی درباره ی ساختار پروتئین فراهم کنند. خواص اسپکترال این اسیدآمینه ها به طور خالص در محلول بررسی شده است. از این خواص طیفی برای تعیین ویژگی های جذبی پروتئین ها در حالت طبیعی و فولد شده در مقایسه با حالت غیرطبیعی و دناتوره شده در حضور گرما برای مشخص شدن میزان پایداری استفاده شده است (119).
شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین.
جدول2: خصوصیات فلوئورسانس اسیدآمینه های آروماتیک.
2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها
2-9-3-1- تاخوردگی(Folding) پروتئین ها
برای اینکه یک پروتئین بتواند به درستی عملکرد های بیولوژیکی خود را انجام دهد باید پایدار و به خوبی فولد شده باشد. گرچه اطلاعات بسیاری درمورد کنفورماسیون و نحوه ی سنتز بیولوژیکی پروتئین ها موجود است اما با این حال در مورد ساختار آن ها و نیز نحوه ی فولد شدن پروتئین ها اطلاعات کمی وجود دارد. همچنین تعیین ویژگی های ساختاری پروتئینی که نیمه فولد شده یعنی زمانی که پروتئین در مرحله ی حدواسط در فرآیند فولد شدن پروتئین ها قرار دارد برای درک مکانیسم فولدینگ اهمیت حیاتی دارد. به این دلیل که ماهیت تعاونی فرآیند فولدینگ اجازه نمی دهد که پروتئین نیمه تاخورده در شرایط حد واسط بیشتر از چند دقیقه در شرایط تعادل و پایدار باقی بماند از این رو مطالعات کینتیکی برای تشخیص حد واسط ها نیاز است. با این حال نشان داده شده که تعدادی از پروتئین ها تحت شرایط دناتوراسیون قادرند پروتئین نیمه تاخورده ی مرحله ی حد واسط خود را به صورت پایدار نشان دهند. شواهدی وجود دارد که نشان میدهد این حد واسط ها که اصطلاحا کره ی مذاب نامیده می شوند در فرآیندهای کینتیکی قابل تشخیص هستند. با این حال بازهم جزئیات مولکولی آن ها را به سختی می توان به طور تجربی حتی در شرایط تعادل مشخص کرد. فقدان اطلاعات در مورد تشکیل حد واسط ها فرآیند تاخوردگی مجدد پروتئین های دناتوره شده را به حالتی که از نظر عملکرد بیولوژیکی طبیعی است بسیار پیچیده می کند. پیچیدگی این فرآیند در مورد مولتی دومین پروتئین بیشتر می باشد (120).
2-9-3-2- مطالعه ی تاخوردگی(Folding) مولتی دومین پروتئین ها
آنالیز ژنوم گویای این مطلب است که بخش قابل توجهی از پروتئین ها بیش از یک دومین دارند. جزئی از پروتئین که دارای ساختار و عملکرد مجزا است و اغلب به صورت مجزا بیان می شود دومین نامیده می شود. برای مثال لایزوزیم با اینکه دو دومین ساختاری دارد اما به عنوان یک پروتئین تک دومین شناخته می شود، به این دلیل که هیچ یک از دومین ها به تنهایی پایدار نیستند. علاوه براین، این تعریف شامل پروتئین های ساخته شده از واحدهای تکراری کوچک که به تنهایی نمی توانند بیان شوند نمی شود. حدود 40 تا 65 درصد پروکاریوت ها حاوی پروتئین های چند دومینی می باشند که این درصد در یوکاریوت ها 65 تا 80 درصد است. در یک پروتئین مولتی دومین، دومین ها با یک اتصال دهنده ی کوتاه و ساختاری و یا یک اتصال دهنده ی بلند و انعطاف

پذیر به هم مرتبط می شوند، همچنین خود این اتصال دهنده ها ممکن است در عملکرد پروتئین دارای نقش مهمی باشند. به طور کلی پیچیدگی فرآیند آنفولدینگ در پروتئین هایی که بیش از یک دومین دارند دیده می شود. این پیچیدگی به این دلیل است که هر دومین می تواند به طور مستقل از دومین دیگر آنفولد شود. برای مطالعه ی دناتوراسیون و فولدینگ مولتی دومین پروتئین ها تکنیک های متفاوتی وجود دارد. طیف سنجی فلوئورسانس یک ابزار قابل اعتماد در مطالعه ی پروتئین هاست. این روش حساسیت و انتخاب پذیری بالایی دارد. تکنیک های دیگر شامل دورنگ نمایی حلقوی و روش پراکنـدگی دینامیـکی نور  (DLS) و غیره می باشند (122-121).
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی
برای اولین بار فلوئورسانس در اواسط قرن 19 توسط سرجان فردریک ویلیام هرشل مطرح شد. فلوئورسانس در واقع شکل ویژه ای از لومینه سانس است. مشخصه ی آن آزاد شدن یک فوتون از مولکولی است که در حین انتقال از حالت برانگیخته به حالت پایه می رسد. این آزاد شدن انرژی با سرعتی معادل با s-1 108 رخ می دهد. انواع فرآیند های فعال و غیرفعال سازی فلوئورسانس در شکل 28 که دیاگرام جابلونسکی (Jablonski Diagram) گفته می شود، نشان داده شده است (این دیاگرام حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها را نشان می دهد).
مراحل اصلی ذکر شده در نمودار به تفصیل در زیر آمده است:
مرحله ی جذب :(Absorption) جذب با تحریک بسیار سریع اتفاق می افتد ( 15-10 ثانیه). انتقالات جذبی از حالت پایه ارتعاشی در تراز الکترونی یکتایی پایه (S0) به ترازهای مختلف ارتعاشی در اولین و دومین حالت الکترونی برانگیخته ( S2و (S1 در شکل نشان داده شده است.
مرحله ی آسایش ارتعاشی :(Vibrational Relaxation) این فرآیند نوعی آسایش غیرتابشی است. ملکول های موجود در حالت های ارتعاشی برانگیخته به سرعت انرژی اضافی ارتعاشی خود را از دست داده و به سطح ارتعاشی پایه در تراز الکترونی مربوطه می روند. انرژی در این حالت به صورت گرمایی یا حرکات ارتعاشی مولکول های حلال از دست می رود. به طور طبیعی آسایش ارتعاشی به صورت گام به گام اتفاق می افتد و شرط انتقال از تراز ابتدایی (νi) به تراز نهایی (νf) رابطه Δν=1 می باشد. این بدان مفهوم است که براثر هر برخورد ملکول با ملکول های حلال، که منجر به غیرفعالسازی غیرتابشی می شود، مولکول برانگیخته یک کوانتوم انرژی ارتعاشی خود را از دست داده و صرفا انتقال به یک تراز انرژی پایین تر در مرحله رخ می دهد. مدت زمان انجام این فرایند 10-10 تا 11-10 ثانیه می باشد.
مرحله ی تبدیل درونی :(Internal Conversion) انتقال الکترون بین دو تراز الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است که به شیوه غیرتابشی صورت می گیرد. شرط انجام این فرآیند همپوشانی نمودارهای انرژی پتانسیل دو تراز الکترونی است، به نحوی که انرژی حالت ارتعاشی پایین تر تراز الکترونی بالاتر و حالت ارتعاشی بالاتر تراز الکترونی پایین تر با هم برابر باشد. این فرآیند می تواند بین دو حالت برانگیخته رخ دهد (S2→S1) و یا بین اولین حالت الکترونی برانگیخته و حالت الکترونی پایه (S1→S0) اتفاق بیافتد. مدت زمان انجام این فرآیند بین حالت های الکترونی برانگیخته، 12-10 ثانیه است. تبدیل درونی از یک حالت برانگیخته الکترونی به حالت الکترونی پایه (S→S0) وابسته به نوع ملکول بوده ولی معمولا در صورتی که تفاوت انرژی زیادی بین S و S0 وجود داشته باشد، کارایی کمتری دارد. بنابراین هیچ گونه هم پوشانی بین چاه های انرژی پتانسیل دو حالت وجود نخواهد داشت. بعد از تبدیل درونی، انرژی اضافی به سرعت از دست رفته و مولکول در پایین ترین سطح ارتعاشی حالت الکترونی پایین تر قرار می گیرد.
مرحله ی فلوئورسانس: انتقال تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی اسپین یکسان است. در مورد بیشتر مولکول ها، الکترون ها در حالت پایه جفت می شوند(با اسپین های مخالف)، بنابراین فلوئورسانس شامل یک انتقال یکتایی-یکتایی است. با توجه به این که تبدیل درونی به تراز S و آسایش ارتعاشی بعد از آن بسیار سریعتر از فلوئورسانس است، فلوئورسانس معمولا از پایین ترین تراز ارتعاشی S به حالت های ارتعاشی مختلف در تراز الکترونی پایه صورت می گیرد. بنابراین حتی اگر جذب به حالت های مختلف یکتایی برانگیخته صورت گرفته باشد تنها یک باند فلوئورسانس دیده می شود. به طور معمول مدت زمان فلوئورسانس 6- 10 ثانیه است. باندهای فلوئورسانس مولکولی عمدتا از خطوطی تشکیل شده که طول موج بلندتر یا فرکانس کمتری (انرژی کمتر) نسبت به باند جذبی خود دارند. شیفت به طول موج های بلندتر، شیفت استوک (Stokes Shift) نیز خوانده می شود.
مرحله ی تبدیل بیرونی :(External Conversion) نوعی آسایش غیرتابشی است که در آن حالت های برانگیخته انرژی اضافی خود را به سایر گونه ها (مثل حلال یا مولکول های حل شونده) می دهند. یکی از مکانیزم های تبدیل بیرونی، خاموشی برخوردی یا دینامیک (Dynamic or Collisional Quenching) است. در این نوع خاموشی، طی برخورد انرژی از گونه برانگیخته به سایر مولکول ها منتقل می شود. بنابراین سرعت خاموشی دینامیک با سرد کردن نمونه کاهش می یابد.
مرحله ی عبور بین سیستمی :(Intersystem Crossing) انتقالات جذبی از حالت های یک تایی به سه تایی ممنوع است. هر چند جذب ضعیفی در مورد برخی مولکول ها امکان پذیر است. تراز برانگیخته سه تایی همچنین می تواند از طریق انتقال الکترون از ترازهای یکتایی برانگیخته پر شود. به این فرآیند، عبور بین سیستمی گفته می شود. این فرآیند مشابه تبدیل درونی است، با این تفاوت که انتقال الکترون بین ترازهایی که چندگانگی متفاوت دارند انجام می شود. بعد از عبور بین سیستمی، مولکول با آسایش ارتعاشی به پایین ترین حالت ارتعاشی در تراز الکترونی که در آن قرار دارد می رود.
مرحله ی فسفرسانس:  به طور معمول تراز های سه تایی که از الکترون پر شده اند به وسیله تبدیل بیرونی و یا عبور بین سیستمی به تراز الکترونی پایه غیرفعال می شوند .(T1→S0) تراز های سه تایی می توانند به وسیله نشر یک فوتون نیز غیرفعال شود. غیر فعال سازی تابشی بین حالت های الکترونی با چندگانگی متفاوت، فسفرسانس خوانده می شود. معمولا مدت زمان انجام فسفرسانس 4-10ثانیه می باشد. بیشتر بودن طول عمر فسفرسانس به دلیل غیرمجاز بودن آن به لحاظ اسپینی است (تغییر چندگانگی اسپین در خلال انتقالات از دیدگاه کوانتمی غیر مجاز است). بنابراین تنها زمانی که احتمال وقوع تبدیل بیرونی با سرد کردن نمونه کاهش یابد فسفرسانس رخ می دهد. طول موج فسفرسانس یک ترکیب مشخص معمولا بلندتر از طول موج فلوئورسانس است، به این دلیل که انرژی T1  از انرژی S1 کمتر است (123).
شکل28: دیاگرام جابلونسکی. حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها.
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD)
روش طیف سنجی CD به طور گسترده ای در ارزیابی ساختار و پایداری پروتئین ها در شرایط مختلف محیطی از نظر دما، قدرت یونی، وجود املاح و مولکول های کوچک مورد استفاده قرار می گیرد. در حال حاضر انجام این تکنیک بدلیل اینکه نسبتا آسان است و نیاز به مقدار کمی از نمونه دارد و هم چنین تجزیه و تحلیل داده ها سریع می باشد، تقریبا در همه آزمایشگاه های درگیر با تجزیه و تحلیل پروتئین ها به طور عمده فراهم است. این تکنیک عمدتا برای مطالعه ساختار دوم پروتئین ها استفاده می شود، هر چند از آن می توان برای مطالعه ساختار پپتیدها و نوکلئیک اسیدها نیز استفاده نمود. مطالعه پروتئین ها با این تکنیک حتی با یک غلظت پایین نمونه (10 – 1 میلی گرم / میلی لیتر) در یک گسترده وسیعی از متغیرهای محیطی (دما، pH، و غیره) قابل انجام است. هم چنین این روش می تواند اطلاعاتی را در مورد اثر لیگاندهای اضافه شده به پروتئین نشان دهد. در مورد پروتئین ها نتایج معمولا به صورت مولار الیپتیسیتی Ellipticity)) بیان می شوند و با نماد  [θ]نشان داده می شود که از فرمول زیر قابل محاسبه می باشد:
در این فرمول الیپتیسیتی با θ ، مسیر نور عبوری بر حسب سانتی متر باl ، جرم مولکولی با M، غلظت پروتئین بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر با C، و تعداد رزیجوهای آمینواسید با n نشان داده شده است. درنهایت [θ]بر حسب deg.cm 2 .dmol -1 بدست می آید (124).
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون
2-9-6-1- دناتوراسیون
دناتوراسیون پروتئینی (شکل 29) می تواند یک فرآیند برگشت پذیر و یا غیر قابل برگشت باشد. دناتوراسیون در واقع به تغییری که در کنفورماسیون پروتئین ایجاد شود و منجر به آنفولد شدن کل ساختار پروتئین شود اطلاق می شود. علاوه براین، چنین تغییراتی بدون شکستن پیوندهای پپتیدی رخ می دهد. در این شرایط پروتئین بدلیل از دست دادن ساختار سوم خود فعالیت بیولوژیکی ندارد. از طرفی دناتوراسیون منجر به در معرض قرار گرفتن گروه های هیدروفوبیکی می شود که این امر تمایل جذب سطحی نقاط هیدروفوبیکی پروتئین ها را به یکدیگر و تشکیل و تجمع رسوب پروتئینی را افزایش می دهد (125).
شکل 29: دناتوراسیون پروتئینی.
2-9-6-2- مطالعه ی پایداری پروتئین ها
در تحقیقات بیومولکولی نظیر مهندسی پروتئین، شیمی پروتئین، کشف و طراحی داروها، تعیین فاکتورهای موثر در پایداری پروتئین ها اهمیت بالقوه ای دارد. در این تحقیقات از روی پارامترهایی نظیر تغییرات انرژی آزاد گیبس (°( ΔG و نیز ویژگی هایی که یک پروتئین در حین عبور از حالت طبیعی و فولد شده به حالت غیرطبیعی و آنفولد شده در حین دناتوراسیون پیدا می کند می توان پایداری ترمودینامیکی را مشخص کرد.
در بین پارامترهایی که پایداری یک پروتئین را تعیین می کنند، می توان به موارد زیر اشاره نمود از جمله به پیوندهای هیدروژنی، تعاملات هیدروفوبیک، پیوندهای واندروالسی، پل های نمکی و تعاملات آروماتیکی که همگی بستگی به نوع ترکیب آمینواسیدهای یک پروتئین دارند و نیز تغییرات پس از ترجمه نظیر گلیکوزیله شدن و متیله شدن که روی پروتئین ایجاد می شوند، همچنین یکسری فاکتورهای محیطی نظیر دما، فشار، نمک ها، PH وغیره هستند که روی پایداری یک پروتئین تاثیر می گذارند. به عنوان مثال اضافه نمودن یک ماده ی شیمیایی نظیر گوانیدین هیدروکلراید و یا اوره منجر به دناتوره شدن پروتئین و متعاقب آن تغییر در پایداری پروتئین می شود (127-126).
2-9-6-3- روش دناتوراسیون شیمیایی
اوره و گوانیدین هیدروکلراید ترکیباتی هستند که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند ( شکل30). این ترکیبات با تخریب پیوند های هیدروژنی منجر به آنفولد شدن پروتئین ها می شوند. در غلظت های بالا از این دناتوره کننده ها به عنوان مثال غلظت 8 مولار برای اوره وغلظت 4 مولار برای گوانیدین هیدروکلراید، پروتئین ها تمایل به آنفولد شدن دارند. در حقیقت دناتوراسیون شیمیایی منجر به از دست رفتن پایداری در پروتئین می شود. در حین دناتوراسیون شیمیایی ساختار اولیه پروتئین دست نخورده باقی می ماند. اما ساختارهای دوم وسوم پروتئین دستخوش تغییر می شوند. در این حالت پروتئین از حالت فولد شده به یکی از دوحالت نسبتا فولد شده و کاملا آنفولد شده می رسد. همچنین وجود مرحله ی حد واسط هم در این واکنش از طریق مطالعات دناتوراسیون شیمیایی قابل بررسی می باشد. فرآیند آنفولدینگ بعضی پروتئین ها در حضور گوانیدین هیدروکلراید سه حالت گذار را نشان می دهد، شامل مرحله ی (N) NATIVE، حد واسط (I) و مرحله ی آنفولد شده (U). وجود مرحله ی حدواسط در حین دناتوراسیون نشان دهنده ی پروتئین در حالت کره ی مذاب می باشد که دارای

مثال از پروتئین گذرنده از غشا، Sefمی باشد که با الگوی مشابه به FGF8 در موش بیان می شود. دو مکانیسم تنظیمی متفاوت برای این مولکول مطرح شده است که یکی این است که احتمالا Sef از طریق برهم کنشی که با FGFR1، FRS2 و مسیرMAP کیناز و Aktمی دهد قادر است مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی را مهار کند و دیگر اینکه ممکن است روی مسیر پایین دست MEK اثر بگذارد. در واقع اثر مهاری Sef روی فعالیت ترانس لوکیشن هسته ای ERK، بدون مهار فعالیت سیتوپلاسمی آن می باشد (52).
مثال دیگر از پروتئین های تنظیمی درسطح تنظیمی گذرنده از غشاء XFLRT3 است که در زنوپوس شناسایی گردیده است. این پروتئین تنظیم گر مثبت مسیر پیام رسانی FGF می باشد. همچنین مولکول های چسبندگی سلولی یا CAMs با ناحیه ی خارج سلولی خود مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی را از طریق مسیر PLCγ/Ca2+ تنظیم می کنند. این فعل و انفعالات به خوبی در مورد سلول های عصبی مطالعه گردیده است (53).
سطح تنظیمی بعدی در سطوح داخل سلولی مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی توسط دو گروه از پروتئین ها صورت می گیرد. در گروه اول PTP ها جای می گیرند که به طور کلی تنظیم کننده های مثبت و منفی پیام رسانی RTK می باشد. گروه دوم SPROUTY پروتئین ها می باشند که در دروزوفیلا شناسایی شده اند. بعدها چهار عضو دیگر از این خانواده در پستانداران شناسایی گردید. تمامی اعضای پروتئین های خانواده ی SPROUTY نواحی حفاظت شده ی غنی از سیستئین در انتهای C-ترمینال خود دارند که به ترانس لوکشین آنها به غشای پلاسمایی و عمل به عنوان یک تنظیم گر منفی کمک می کند. پروتئین های Sprouty در واقع به عنوان مولکول تنظیمی منفی در مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی عمل می کند (54).
2-2- فلز چیست؟
فلز ماده‌ای است که می‌توان آن را صیقل داده و براق کرد ( بجز جیوه که در دمای اتاق به شکل مایع است) یا به طرح‌های گوناگون درآورد و از آن مفتول‌های سیمی ظریف تهیه کرد(56-55).
2-2-1- فلزات سمی
فلزات سنگین که سرب، آلومینیوم، جیوه، مس، کادمیوم، نیکل و آرسنیک را شامل می گردد از سموم پرخطر پیرامون ما می باشند. این سموم در هوای تنفسی، آب آشامیدنی، مصالح ساختمانی، لوازم آشپزخانه و حتی البسه موجود می باشند. برخی فلزات به مقدار ناچیز برای عملکرد طبیعی بدن ضروری هستند، اما ورود بیش از اندازه آن ها به بدن مسمومیت ایجاد خواهد کرد .ایراد اصلی فلزات سنگین این است که در بدن متابولیزه نمی گردند. در واقع فلزات سنگین پس از ورود به بدن دیگر از بدن دفع نشده و در بافت های بدن انباشته می گردند و همین امر موجب بروز بیماری ها و عوارض متعددی در بدن می شود.
فلزات سمی، فلزاتی هستند که به صورت ترکیبات محلول، سمی هستند و نقش بیولوژیکی ندارند و مواد معدنی ضروری نیستند. اغلب تصور می شود که فلزات سنگین هم خانواده آنها هستند اما برخی فلزات سبک هم سمی هستند، مانند برلیوم. همچنین همه فلزات سنگین سمی نیستند، بلکه برخی از آنها مانند آهن ضروری می باشند. گاهی این فلزات سمی از عمل یک عنصر ضروری در بدن تقلید می کنند که باعث تداخل در پروسه متابولیک (سوخت و ساز) شده و در نتیجه منجر به بیماری می شوند، از جمله آن، تداخل درعمل سیگنالینگ است.
سمیت یک عملکرد محلول است، ترکیبات نامحلول، همچنین اشکال فلزی، اغلب سمیت ناچیزی را نشان می دهند. موجودات زنده به میزانهای مختلف به فلزات نیاز دارند. میزان زیاد آنها می تواند مخرب بوده و منجر به تخریب یا کاهش عملکرد ذهنی و اعصاب مرکزی شوند. برخی اثرات شامل: اثر روی سیستم عصبی توسط سرب، اثر روی کلیه و کبد توسط سرب و کادمیوم، اثر بر روی پوست و استخوان توسط نیکل و کادمیوم است. اختلالات عصبی (پارکینسون، آلزایمر، افسردگی و اسکیزوفرنی)، انواع سرطان ها، سقط جنین، اختلالات تنفسی و قلبی-عروقی، ناباروری، تضعیف سیستم ایمنی بدن، دیستروفی عضلانی و مولتیپل اسکلروز، تخریب ژن ها و مرگ از جمله مضرات فلزات سمی می باشد.(59-57).
2-2-3- سرب
سرب از عنصرهای شیمیایی واسطه در جدول تناوبی است. سرب عنصر شیمیایی است که در جدول تناوبی با نشان Pb و عدد اتمی ۸۲ وجود دارد. موارد استفاده معمولی سرب به شرح زیر است: در باطریهای اسید سرب، در اجزای الکترونیکی، در باطری خودرو، سرامیک ها، خاکستر سیگار، دود اگزوز خودروها، بنزین سرب دار و غیره. سرب فلز سمی است که به پیوندهای عصبی آسیب رسانده (بخصوص در بچه‌ها) و موجب بیماریهای خونی و مغزی می‌شود. تماس طولانی با این فلز یا نمکهای آن، مخصوصاً نمکهای محلول یا اکسید غلیظ آن PbO2 می‌تواند باعث بیماریهای کلیه و دردهای شکمی شود. حدود 7% سربی که انسان از طریق غذا دریافت می کند توسط گوشت است. طبق توصیهWHO دریافت سرب توسط انسان نباید در هفته بیش از 3 میلی گرم باشد، یعنی 400 میکروگرم در روز. حالت مسمومیت زمانی ایجاد می شود که میزان سرب بین 6/0 تا 1 میکروگرم در خون باشد و کودکان چون 6 برابر بزرگسالان قدرت جذب سرب از طریق غذا را دارند در معرض خطر بیشتری هستند. سرب معمولاً با توجه به ترکیب غذا و وضعیت فیزیولوژیک دستگاه گوارش در بزرگسالان به میزان 5 تا 10% و در کودکان تا 50% توسط روده ها جذب می شود. میزان جذب سرب از طریق دستگاه تنفسی بالاتر بوده و بین 30 تا 50% می باشد (64-60).
2-2-4-کادمیوم
کادمیوم، عنصر شیمیایی است که در جدول تناوبی با نشان Cd و عدد اتمی ۴۸ قرارگرفته ‌است. کادمیوم در آلیاژهای دندانی، باطری ها، روغن موتور، غذاهای دریایی، سرامیک ها، دود سیگار، چای و قهوه، کودها و غیره وجود دارد. کادمیوم از معدود عناصری است که هیچگونه نقش ساختاری در بدن انسان ندارد. این عنصر و محلول ترکیبات آن حتی به میزان بسیار کم، سمی هستند و در اندام‌ها و محیط زیست ذخیره می‌شوند. استنشاق گرد کادمیوم به سرعت در دستگاه تنفسی و کلیه‌ها ایجاد مشکلاتی می‌کند که می‌تواند کشنده باشد (اغلب از نارسائی کلیوی). خوردن هر مقدار قابل ملاحظه‌ای از کادمیوم موجب مسمومیت سریع کبد وکلیه‌ها می‌گردد. ترکیباتی که محتوی کادمیوم هستند نیز باعث مسمومیت می‌شوند (69-65).
2-2-5- نیکل
نیکل عنصری است فلزی با عدد اتمی ۲۸، نماد علمی Ni که در گروه VII و در دوره چهارم جدول تناوبی جای دارد. نیکل در بیکینگ پودرها، پروتزهای دندانی، دود اگزوز خودروها، پسماندهای صنعتی، غذاهای فرآوری شده، کودها، روغن های هیدروژنه، ظروف استنلس استیل موجود می باشد. مقدار اندک نیکل برای انسان ضروری است اما اگر مقدار آن افزایش یابد، برای سلامت انسان خطرناک است و شانس مبتلا شدن به سرطان ریه، سرطان بینی، سرطان حنجره و سرطان پروستات را افزایش می دهد. آب آوردن ریه ها، مشکلات تنفسی، کاهش توانایی تولید مثل، آسم و برونشیت مزمن، حساسیتهایی از قبیل خارش پوست (به خصوص در هنگام استفاده از جواهرات) از مضرات آن می باشد. از لحاظ تقسیم بندی برنامه سم شناسی ملی آمریکا (NTP)، نیکل و ترکیبات آن جز عوامل سرطانزا محسوب می شوند و از نظر طبقه بندی آژانس بین المللی تحقیقات سرطان (IARC) ترکیبات نیکل در گروه یک قرار می گیرند (75-70).
2-2-6-آلومینیوم
آلومینیوم عنصری شیمیایی در گروه بورون با عدد اتمی ۱۳ و نماد Al است. آلومینیوم در ظروف آلومینیومی، فویل، قوطی ها، برخی داروها (مانند ضد اسید معده)، سرامیک ها، فیلتر سیگار، مصالح ساختمانی ،آمالگام دندان، دئودرنت ها، آفت کش ها، نمک خوراکی، دود سیگار، بیکینگ پودر، خمیر دندان نیز موجود می باشد. آلومینیوم یکی از معدود عناصر فراوانی است که ظاهراً هیچ فعالیت موثری در سلولهای زنده ندارد. در انسان آلومینیوم مانند فلزات سنگین، سمی نیست، اما در صورت مصرف زیاد علائمی از مسمومیت دیده شده ‌است. بعلاوه احتمال ارتباط آلومینیوم با بیماری آلزایمر مطرح شده‌ است. مصرف زیاد این عنصر باعث کم خونی نیز می‌گردد. بیماری های ناشی از مصرف زیاد آلومینیوم شامل: آلزایمر، پارکینسون، آرتریت روماتوئید، بیماریهای استخوانی، اختلالات خودایمنی، آلرژیها، صرع، یبوست، مشکلات قلبی، بیش فعالی، بیماری های کلیوی، پوکی استخوان و اسکیزوفرنی که با مصرف زیاد آلومینیوم در ارتباط است .گاهی این فلزات سمی از عمل یک عنصر ضروری در بدن تقلید می کنند که باعث تداخل در پروسه متابولیک (سوخت و ساز) شده و در نتیجه منجر به بیماری می شوند، از جمله، تداخل درعمل سیگنالینگ است(79-76).
2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ
مطالعات اخیر نشان داده است که فعالیت انواع مسیرهای سیگنالینگ که در مواجه با فلزات ایجاد می شود، می تواند بر بیان ژنهای متعددی که نقشهای مهمی را در سرطانزایی به عهده دارند، اثر بگذارد. فلزات باعث تولید مسیرهای سیگنالینگ می شوند که به طور عمده شامل مسیرهای: ROS, MAPKs, PI3K, HIF-1, NF-kB, NFAT و AP-1 می باشد(82-80).
2-7-1-ROS
گونه های اکسیژن فعال (ROS)، مولکول های بسیار واکنش پذیر با الکترونهای جفت نشده در طی متابولیسم اکسیداتیو می باشند. آنها شامل آنیون سوپر اکسید (O2-)، رادیکال هیدروکسیل (OH) و پراکسید هیدروژن (H2O2) هستند که به طور مداوم در سیستم های بیولوژیکی تولید و حذف می شوند و نقش مهمی در تنظیم تکثیر سلولی، آپوپتوز، تحول و پیری به عهده دارند.
سلول ها با آنتی اکسیدانهای پاک کننده قادر به دفاع در برابر این استرس هستند مانند: آسکوربات، گلوتاتیون و تیوردوکسین و آنزیم های آنتی اکسیدان مانند: سوپراکسیددسموتاز [SOD]، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و تیوردوکسین ردوکتاز. با این سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی، سلول ها می توانند با غلظت های فیزیولوژیکی کم از ROS ، انطباق یابند. با این حال، ROS می تواند سبب آسیب اکسیداتیو ماکرومولکولهای سلولی شود، از جمله DNA، پروتئین ها، و چربی ها. وقتی میزان آن افزایش می یابد، سبب افزایش دفاع های آنتی اکسیدان می شود.
ROS نقش مهمی را در شروع آسیب سلولی دارد که می تواند منجر به ایجاد سرطان شود. یکی از مهمترین راههایی که ROS باعث سرطان می شود، عمل کردن به عنوان پیامبرهای انتقال سلولی است که سبب فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ از جملهMAPK, PI3K, NF-kB و NFAT می شود (شکل 15). بنابراین ما ROS را در بحث اثرات ترکیبات فلزی در مسیرهای سیگنالینگ در نظر می گیریم. مطالعات نشان داده است که سلولهای در معرض Pb, Cd, Ni, As, Coو Cu ، همچنین بسیاری از ترکیبات فلزی دیگر، می توانند سبب تولید ROS اضافی در سلولها شوند(83-81).
شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS.
2-7-2- MAPK
پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن (MAPK) مسیر سیگنالینگ، نقش مهمی را در کنترل برنامه های بیان ژن در پاسخ به سیگنال های خارج سلولی در سلول های یوکاریوتی دارد. چهار گروه اصلی از خانواده MAPK در سلولهای پستانداران وجود دارد که آنها سرین/ تره اونین کینازها هستند: کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی (ERK)، کیناز N- ترمینال c-jun (JNK)، p38 و کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی شماره 5 (ERK5) / MAPK-1 بزرگ (BMK1). هر گروه همچنین شامل تعدادی ایزوفرم هستند. مسیرهای سیگنالینگ اصلی MAPK، یک سری آبشار فسفوریلاسیون است (شکل 16).
جهت دریافت سیگنالهای خارج سلولی مانند فاکتورهای رشد، هورمون ها و محرک های استرس، MAPKs بوسیله فسفوریلاسیون تره اونین و تیروزین با کینازهای MAPK (MAPKK) فعالیت می کنند، که بوسیله فسفوریلاسیون سرین/ تره اونین با کینازهای کیناز MAPK فعال می شوند (MAPKKK). با فعال شدن، MAPKs می تواند فعالیت فاکتورهای رونویسی و تنظیم کننده های رونویسی را بوسیله

فسفوریلاسیون تغییر بدهد که منجر به تغییرات در بیان ژنهایی می شود که حدواسط رشد سلول، تکثیر، تمایز، آپپتوز و تغییر شکل می باشند. مطالعات نشان داده است که برخی فلزات مانند نیکل، کادمیوم و … ، می توانند مسیرهای MAPK را فعال کنند(85-84).
شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن.
2-7-3- PI3K/Akt
مسیرهای فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز(PI3K)، در رشد سلول، تمایز و آپپتوز، نقش دارند. یک کیناز لیپیدی بوسیله تواناییهایش در فسفریله کردن فسفواینوزیتیدها (PIPs) در ناحیه 3´-OH حلقه اینوزیتول در غشای سلولی شناخته می شود. در فعال سازی توسط پروتئین تیروزین کینازهای گیرنده های فاکتور رشد، PI3K در غشاء سلول قرار می گیرد، جایی که PIPs را به منظور تولید پیامبر ثانویه فسفاتیدیل اینوزیتول 3,4,5- تری فسفات (PIP3) فسفریله می کند (شکل 17).
As, Cd, Co, Ni, and V نشان داده شده که می توانند باعث فعالیت مسیرهای PI3K/Akt بشوند (86).
شکل 17: مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز.
2-7-4- HIF
فاکتور رونویسی القاء شده 1 در شرایط هیپوکسی، نقش مهمی در هموستاز اکسیژن سلولی بازی می کند. در شرایط نرمال اکسیژن، به سختی قابل تشخیص است، اما به طور چشمگیری در شرایط هیپوکسی القاء می شود. در نتیجه فعالیت HIF-1، رونویسی از ژنهای مربوط به سرطان درگیر در رگزایی، بقای سلولی، حمل و نقل قند و سوخت و ساز بدن را تحریک می شود. به عنوان مثال باعث تنظیم فاکتور رشد اندوتلیال عروقی می شود که نقش مهمی را در تومور و رگزایی دارد (شکل 18).
کبالت و نیکل عوامل شناخته شده ای هستند که شرایط هیپوکسی را تقلید کرده در نتیجه باعث فعالیت HIF-1 می شوند. کادمیوم، کروم و آرسنیک هم گزارش شده که مسیر HIF-1 را فعال می کنند(88-87).
شکل 18: فاکتور رونویسی القاء شده 1.
2-7-5- NF-kB
در ابتدا به عنوان فاکتوری در هسته سلولهای B، به عنوان تقویت کننده زنجیره سبک کاپای ایمونوگلوبولین، سپس در تمام انواع سلولها یافت شد (شکل 19). در پاسخ به محرکهای التهابی، پروموتور تومور، سرطان زایی، پروتئین های ویروسی یا میتوژن، IkB، فسفوریله و یوبی کویینه شده، که منجر به تخریبش می شود. تخریب IkB، باعث آزاد شدن NF-kB جهت انتقال به هسته ها شده؛ جایی که رونویسی از ژن های ویژه ای را تنظیم می کند که حد واسط عملکردهای سلولهای مختلف هستند مانند: التهاب، ترانسفورماسیون، تکثیر، تهاجم، رگزایی، متاستاز و آپپتوز.
گرچه NF-kB، برای عملکرد نرمال سیستم ایمنی تنظیم می شود، اما عدم تنظیمش زمانی که NF-kB بیش از حد بیان می شود، در انواع سرطان ها نقش دارد. فلزات مانند: کادمیوم، نیکل، آرسنیک و …، بر عملکرد NF-kB، اثر می گذارند(89).
شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB.
2-7-6- NFAT
فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T (شکل 20)، پروتئین های جزء خانواده فاکتورهای رونویسی هستند که فعالیتشان بوسیله Ca و Ca/calmodulin-dependent serine phosphatase calcineurin کنترل می شود. NFAT نقش های زیادی را در خارج سیستم ایمنی بازی می کند که شامل: تمایز، رگزایی، غضروف زایی و چربی زایی می باشد. در زمان استراحت سلولی، پروتئین های NFAT، فسفریله هستند و در سیتوپلاسم قرار می گیرند. در تحریک، در طی افزایش کلسیم، بوسیله کلسینورین دفسفریله می شوند و به هسته انتقال می یابند. هنگامی که در هسته، پروتئین NFAT فعال شده و به سایت های DNA متصل می شود، کنترل رونویسی از ژنهای هدف در آن صورت می گیرد.
در قطع سیگنالینگ کلسیم، پروتئین NFAT، دوباره فسفریله شده و به سیتوپلاسم برمی گردد، در نتیجه فعالیتشان پایان می یابد. نشان داده شده است که نیکل، آهن و وانادیوم، NFAT، را فعال می کنند(91-90).
شکل 20: فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T.
2-7-7- AP
فعال کننده فاکتور رونویسی، پروتئین 1، (AP-1)، یک کمپلکس دایمر است که ازخانواده های JUN, FOS, ATF و MAF تشکیل شده است. فرم اصلی AP-1 در بسیاری از سلولها هترودایمر Fos/Jun است که تمایل بالایی برای اتصال به عامل حساس TPA (TRE)، دارد (شکل 21).
C-jun و C-fos، به عنوان تومورزا در نظر گرفته می شوند و با سرطان ها همراه هستند. تحریک خارج سلولی مانند سایتوکاین ها، اشعه UV، فاکتورهای رشد، ROS وسرطانزاها می توانند سبب القاء AP-1 شوند و سبب افزایش اتصال AP-1 به TRE ژنهای هدف، که در رشد سلول، پاسخ های التهابی و فرآیندهای بازسازی دخیل هستند. نشان داده شده است که کادمیوم، نیکل، کروم و …، می توانند AP-1 را فعال کنند(92).
شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1.
2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن
2-8-1- سرب
– سرب می تواند مانند یک پروموتر تومور در فیبروبلاستهای انسان عمل کند. اگرچه اثر سرب بر ROS نسبت به کادمیوم کمتر است، ولی همان می تواند سبب سمیت سلولی شود. پیشنهاد شده است که سرب در سطح سلولی و مولکولی ممکن است امکان ایجاد و یا افزایش عوامل سرطان زایی را بکند که در آسیب DNA و تنظیم پروموتر ژن ها، نقش دارد(94-93).
– مطالعات خاطر نشان کرده است که در معرض سرب قرار گرفتن، منجر به فسفوریلاسیون پروتئین tau در مغز رتهای آزمایشگاه شده است. طبق تحقیقات، قرار گرفتن در معرض سرب در اوایل زندگی می تواند جهت رشد شناختی مضر باشد که به IQ کمتر از حد انتظار در برخی از کودکان منجر می شود. همچنین هایپرفسفوریلاسیون پروتئین تائو در مغز منجر به اثرات مشابهی می شود که شاید همان نوع اختلال شناختی است (95).
– قبلا گزارش شده است که مواجهه با سرب هم در پیش سیناپس و هم در پس سیناپس، به دلیل مهار رسپتور N- متیل دی آسپارتات (NMDAR) باعث تغییرات در گسترش نورونها می شود.
NMDAR در طی سیناپس سازی بوسیله سرب مهار می شود که سیگنالینگ ترانس سیناپس پایین دست یعنی فاکتور نوروتروفیک مشتق شده از مغز (BDNF) را مختل می کند (شکل 22) و BDNF اگزوژن اضافی می تواند اثرات سرب را، هم در پروتئین بیانی پره سیناپتیک و هم در آزاد شدن حفره پره سیناپتیک بهبود ببخشد.
فعالیت NMDAR سایر مسیرهای سیگنالینگ ترانس- سیناپتیک ، مانند سیگنالینگ اکسید نیتریک (NO) را می تواند تنظیم کند. بنابراین، ممکن است که دیگر مسیرهای انتقال سیناپسی علاوه بر سیگنالینگ BDNF، توسط Pb+2 مختل شود.
BDNF-TrKB ، یک فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز است، یک نوروتروفین که عملکرد مهمی را در نورون و گسترش سیناپس دارد. سرب با ایجاد اختلال در سیگنالینگ BDNF-TrKB، باعث عدم تنظیم توسعه سیناپس و عملکرد صحیح می شود(96).
شکل 22: عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز.
– قرار گرفتن در معرض سرب از منابع زیست محیطی و صنعتی، به طور جدی در بهداشت عمومی نادیده گرفته شده است. توضیح اثر سرب بر روی عملکرد سلول استخوان، اساسی است برای فهمیدن خطرش که با بیماری های کم شدن توده استخوانی همراه است. این فرضیه که سرب، اثرات منفی بر توده استخوانی دارد آزمایش شده است. همچنین مکانیسم های زیر بنایی از سرب در مسیرهای سیگنالینگ استخوان، ارزیابی شده است(97).
– اثرات نوروتوکسیک ناشی از در معرض میزان کم سرب در محیط، مشکل قابل توجهی بویژه در بچه ها و نوزادان در تمام دنیا می باشد. مطالعات متعددی نشان داده است که سرب وقتی که غلظتش در خون بالا برود می تواند در مغز تجمع یابد. مکانیسم اثر سرب در مغز، هنوز به طور کامل مشخص نیست. سلولی که مسئول پاسخ گویی به تجمع و ذخیره سرب در سیستم عصبی مرکزی (CNS) است، استروگلیا می باشد.
ERK ½ (کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی ½)، عامل مهمی در شکل گیری پروسه تقویت یا پتانسیل طولانی مدت (LTP)می باشد. سرب با مختل کردن بیان ERK و سایر مولکول های سیگنال میتواند بر LTP اثر بگذارد. فاکتور رشد فیبروبلاستی پایه (bFGF)، یکی از فاکتورهای نوروتروفیک است که می تواند سلولهای نورون را در برابر تخریب سم، حفظ کند. به منظور بررسی اثر حفاظتی احتمالی bFGF روی استروگلیای اولیه کشت داده شده، مشاهده کردند که mRNA و بیان پروتئین ERK در استروگلیا، با bFGF درمان می شود. نتایج نشان داده است که bFGF اگزوژن می تواند از فعالیت ERK برعلیه تاثیر سرب حفاظت کند. بنابراین، bFGF بوسیله مسیر سیگنالینگ MEK1/ERK ممکن است یک فاکتور تنظیم کننده حمایتی و نوروتروفیک باشد (99-98).
2-8-2- کادمیوم
– علاوه بر اثرات مخرب وسیع بر سلامت انسان، فلزات سمی مانند کادمیوم می توانند باعث پیشرفت سرطان شوند. ویژگیهای سمی این فلزات تا حدودی به تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS)، مرتبط هستند که می توانند سبب تخریب DNA و سبب فرآیندهای اکسیداسیون احیای وابسته به فاکتورهای رونویسی شوند. (شکل 23). علاوه بر تخریب DNA، ROS می تواند سبب القاء چندین مسیر سیگنالینگ خارج سلولی بویژه NF-kB, JNK/SAPK/p38 و همچنین Erk/MAPK شود.
این مسیرهای سیگنالینگ می توانند منجر به القاء رونویسی از ژنهای هدفی شوند که می توانند سبب تکثیر یا تبدیل مقاومت آپوپتوز به سلول در معرض شوند. کادمیوم در معرض سلولها می تواند سبب تولید ROS، فعالیت MAPKs, NF-kB و AP-1 شود اما HIF-1 را سرکوب می کند(101-100).
شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ.
– کادمیوم می تواند پروتئین کینازهای سلولی (PKC) را فعال کند که منجر به افزایش فسفوریلاسیون فاکتورهای رونویسی مختلف شده و در عوض منجر به فعالیت بیان ژن هدف شود. مکانیسم های سمیت کادمیوم هنوز به خوبی مشخص نشده است، اما مشخص است که به صورت خارج سلولی بویژه از طریق رادیکال آزاد مخرب، به ویژه در ریه ها، کلیه ها، استخوان، سیستم عصبی مرکزی، اندامهای تناسلی و قلب عمل می کند(102).
– MAPKs(i.e., ERK, JNK, & p38)، وقتی در معرض کادمیوم قرار می گیرند با حساسیت های مختلف فعال می شوند. اینکه مسیرهای سیگنالینگ در مواجه با فلزات سنگین یا منجر به حفاظت سلولها می شوند یا مرگ سلولی، هنوز کاملا شناخته نشده است. پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژن (MAPKs)، مانند پروتئین کیناز تنظیم کننده سیگنال خارج سلولی (ERK)، c-Jun, JNK و p38، سبب انتقال سیگنالهای خارج سلولی به هسته می شود و نشان داده شده است که برای شرکت در زمینه های گوناگون از اعمال سلولی مانند رشد سلول، تمایز و آپوپتوز نقش دارند (شکل 24).
مواجهه با کادمیوم، می تواند ERK, JNK و p38 MAPK را فعال کند و سبب القاء بیان ژنهای c-fos و c-jun اولیه جهت گسترش آپپتوز شود. با این حال به نظر می رسد که اعضای خانواده MAPK به طور متفاوت؛ بسته به فلز سنگین و نوع سلول در معرض، فعال می شوند. در نتیجه، پاسخ های سلولی مختلف ممکن است توسط الگوی مشخص از فعالیت MAPKs، ایجاد شود. MAPKs ممکن است یکی از مسیرهای مهم انتقال سیگنال سلولی باشد که تحت تاثیر آلودگی های زیست محیطی، از جمله فلزات سنگین، قرار می گیرد (103).
شکل 23: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK.
– اثرات شبه استروژن کادمیوم و افزایش خطر سرطانهای وابسته به هورمون ناشی از در معرض کادمیوم قرار گرفتن در چندین مطالعه گزارش شده است. کادمیوم بر روی مسیرهای سیگنالینگ سلولی بویژه بر روی سیگنالینگ استروژن موثر است. Cd به طور قابل توجه ای بر فسفوریلاسیون کیناز و بیان ژن اثر می گذارد و فسفوریلاسیون ERK1/2 را به طور قابل توجه ای افزایش می دهد (104).
– ساختارهای zinc-finger که در فاکتورهای رونویسی و پروتئین های ترمیم DNA یافت می شوند، واسطه های اتصال protein-protein و DNA-proteinمیباشند. در غلظت های پائین این فلزات(Cd,Ni,Co,Ars) مداخله در رونویسی DNA و ترمیم دیده شده است. واکنش یونهای فلزات سمی

ه یکدیگر متصل می‌شوند تا یک پلی پپتید را به وجود بیاورند.
اسیدهای آمینه در شکل پروتئین خود فعالیتهای زیستی بی شماری از نظر ساختمانی، هورمونی و کاتالیزوری دارند. اسیدهای آمینه دارای یک گروه بازی ازته، که عموماً یک گروه آمینی (-NH2) است و یک واحد کربوکسیل اسیدی (COOH)، می باشند (شکل 4).
شکل 4: ساختمان اصلی یک اسید آمینه.
2-1-1- ساختمان پروتئین ها
پروتئین ها در واکنش های بدن و ساختمان آن نقش عمده دارند و نوع فعالیت آنها به ساختمان آنها بستگی دارد. بر اساس توالی اسیدآمینه، نوع، تعداد و چگونگی آرایش فضایی حاصل، پروتئین ها دارای 4 ساختمان اولیه، ساختمان نوع دوم، نوع سوم و نوع چهارم هستند.
2-1-1- 1- ساختمان اولیه
ساختمان اول پروتئین ها در ارتباط با ترتیب اسیدهای آمینه در زنجیره پلی پپتیدی است. با دانستن تعداد اسیدهای آمینه، نوع و توالی قرار گرفتن آنها ساختمان نوع اول مشخص می شود.
ساختمان اول توالی اسیدهای آمینه یا به عبارت دیگر آرایش اسیدهای آمینه در یک زنجیره پلی‌پپتید خطی است (شکل 5). دو پروتئین مختلف که تشابه معنی‌داری در ساختمان اول داشته باشد گفته می‌شود که با یکدیگر همولوگ هستند و بنابراین توالی DNA آنها نیز مشابه است. باور عمومی بر این است که دو پروتئین همولوگ از نظر تکاملی نیز بهم مرتبط هستند و از یک ژن اجدادی مشترک تکامل یافته‌اند.
2-1-1-2- ساختمان نوع دوم
ساختمان دوم بطور عمده از رشته های بتا و مارپیچ آلفا ساخته شده است (شکل 5). تشکیل ساختمان دوم در یک منطقه محلی از زنجیره پلی‌پپتیدی تا حدی بوسیله ساختمان اول تعیین می‌شود. توالیهای آمینواسیدی خاصی برای رشته‌های بتا یا مارپیچ آلفا مناسب است و بقیه برای تشکیل مناطق حلقه مناسب هستند. عناصر ساختمان دوم معمولاً خودشان را در شکل موتیف‌های ساده آرایش می‌دهند. موتیف‌ها بوسیله چفت شدن زنجیره‌های جانبی مارپیچ‌های آلفا یا رشته های بتای مجاور و نزدیک بهم تشکیل می‌شوند. معمولاً چندین موتیف برای تشکیل ساختارهای فشرده کروی ترکیب می‌شوند که دومِین نامیده می‌شوند.
ساختمان نوع دوم پروتئینها به ساختار زنجیره اسیدهای آمینه ای اطلاق می گردد که حاصل ایجاد پیوند
هیدروژن بین گروههای ایمینو و کربونیل اسیدهای آمینه مجاور می باشند.
1- منظم باشد زنجیره پلی پپتیدی مارپیچ α و صفحه β
2- یک کلاف گرد نامنظم باشند.
دلیل بروز چنین مارپیچ α ، وجود پیوندهای هیدروژنی است.
2-1-1- 2-1- مارپیچ آلفا
در صورتی که پیوندهای هیدروژنی در یک زنجیره پلی پپتیدی ایجاد شوند، پیوند بسیار پایداری حاصل می شود. صفحات اصلی یک زنجیره پپتیدی دور یک محور فرضی چرخش یافته و یک فرم مارپیچ را به ساختار فضایی می دهد.
 مارپیچ آلفا یک مارپیچ راست‌گرد است که ساختار آن هر ۴/۵ آنگستروم یک‌بار تکرار می‌شود. در هر دو مارپیچ آلفا، ۶/۳ اسید آمینه وجود دارد. یعنی هر ۵/۱ آنگستروم یک اسید آمینه در طول مارپیچ آلفا قرار می‌گیرد. هر گروه کربوکسیل و آمین در مارپیچ آلفا با اسید آمینه‌ای با فاصله چهار تا از خود، دارای باند هیدروژنی می‌باشد و این الگو در سراسر مارپیچ، غیر از چهار اسیدآمینه در دو انتهای آن تکرار شده‌ است.
مارپیچ آلفا از عناصر کلاسیک ساختمان پروتئین است که اولین بار در سال 1951 توسط پائولینگ توصیف شد. او پیشگویی کرد که این ساختمان باید پایدار و از نظر انرژتیک در پروتئین مناسب باشد.
مارپیچ آلفا در پروتئین وقتی پیدا می شود که در یک قطعه از توالی، همگی زوایای φ و ψ تقریباً 60- و 50- داشته باشند. همه پیوند های هیدروژنی در یک مارپیچ آلفا در یک جهت هستند، به دلیل آنکه واحد های پپتیدی در یک جهت در طول محور مارپیچ دنبال هم قرار گرفته اند.
اثر کلی یک دو قطبی خالص برای مارپیچ های آلفا این است که یک بار مثبت جزئی درانتهای آمینو و بار منفی جزئی در انتهای کربوکسی مارپیچ آلفا دارد. این بار برای جذب لیگاند های با بار مخالف و لیگاندهای با بار منفی بویژه آنهاییکه دارای گروه فسفات هستند و معمولاُ به انتهای نیتروژن مارپیچ آلفا وصل می شوند اثر دارد.
دیده شده است که زنجیره های جانبی مختلف تمایل ضعیف اما معینی برای حضور در مارپیچ آلفا یا عدم حضور در آن دارند. بنابراین آلانین، گلوتامیک اسید، لوسین و متیونین تشکیل دهنده های خوب مارپیچ آلفا هستند، در حالیکه پرولین، گلایسین، تایروزین و سرین از این نظر بسیار ضعیف هستند. چنین تمایلاتی برای هر تلاش اولیه برای پیشگویی ساختمان دوم از توالی اسیدهای آمینه نقطه مرکزی هستند اما به اندازه کافی قوی نیستند که پیشگویی دقیقی را باعث شوند. عمومی ترین مکان برای مارپیچ های آلفا در ساختمان پروتئین در طول سطح خارجی پروتئین است که یک سمت از مارپیچ به طرف حلال و سمت دیگر به طرف آبگریز داخلی پروتئین است. بنابراین با 6/3 اسیدآمینه در هر دور تمایلی برای زنجیره های جانبی به تغییر از آبگریز به آبدوست با تناوب سه یا چهار اسید آمینه وجود دارد. هر چند این گرایش بعضی مواقع در توالی اسیدهای آمینه دیده می شود اما به اندازه کافی برای پیشگویی ساختمان به تنهایی کافی نیست. زیرا اسید آمینه هایی که به سمت محلول هستند می توانند آبگریز باشند و به علاوه مارپیچ های آلفا می توانند بطورکامل در داخل پروتئین یا کاملاً در معرض حلال باشند.
2-1-1 -2-2- صفحه‌های بتا
ساختار صفحه‌های بتا، ساختار دوم بسیارکشیده و چین‌دار می‌باشند. یکی از تفاوت‌های مهم صفحه‌های بتا با مارپیچ آلفا این است که اسیدآمینه‌هایی که معمولاً در ساختار اول زنجیره پروتئینی با فاصله زیاد از هم قرارگرفته‌اند، برای تشکیل این ساختار در مجاورت یکدیگر قرار می‌گیرند، بنابراین صفحه‌های بتا تمایل به سختی داشته و انعطاف‌پذیری ناچیزی دارند. پیوندهای هیدروژنی بین‌رشته‌ای که میان گروه‌های CO یک رشته بتا و NH رشته بتای مجاور ایجاد می‌شوند، به صفحات بتا پایداری می‌بخشند و باعث می‌شوند که این صفحات ظاهری زیگزاگ داشته باشند.
صفحات زنجیره های پلی پپتیدی مختلف که دارای استخوان بندی پله پله هستند به کمک پیوندهای هیدروژنی زوایایی بین خود ایجاد می کنند. اکسیژن عامل کربنیل یک زنجیره پلی پپتیدی + هیدروژن ازت زنجیره پلی پپتیدی پیوند هیدروژنی ایجاد می کنند که به آنها صفحات چین دار یا ساختمان β گویند.
رشته های بتا برای تشکیل صفحات چین خورده به دو طریق میتوانند با هم میان کنش داشته باشند، یا به حالت صفحه موازی همسو و یا به حالت موازی ناهمسو.
2-1-1-3- ساختار سوم
ساختار سوم، به حالت سه‌بعدی که پروتئین بعد از پیچش به خود می‌گیرد، گفته می‌شود (شکل 5).
اصطلاح ساختمان سوم را به عنوان یک اصطلاح مشترک هم برای طریقه آرایش موتیف‌ها به ساختمان‌های دومِین و هم برای راهی که یک زنجیره پلی‌پپتیدی به چندین دومِین تا می‌خورد بکار می‌بریم. در همه مواردی که مشاهده شده، نشان داده شده است که اگر توالی اسیدهای آمینه در دو دومِین در پروتئین‌های مختلف همولوژی داشته باشند، این دومِین ها ساختمان سوم مشابه دارند.
2-1-1-4- ساختار چهارم
ساختار چهارم به حالت قرارگیری چند پروتئین در فضا کنار یکدیگر گفته می شود (شکل 5). بیشتر پروتئین‌ها از پیوند زنجیرهای پلی پپتیدی مشابه و یا متفاوت ساخته شده‌اند، اتصال بین زنجیرها توسط پیوندهای ضعیف تری برقرار می‌گردد. این ساختار ترتیب قرارگرفتن زیر واحدهای یک پروتئین را شرح می‌دهد و نقش مهمی در توضیح چگونگی شرکت پروتئین در واکنش‌های شیمیایی دارد (20-18).
شکل 5: ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین.
2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی
تعداد 518 پروتئین کیناز در ژنوم انسان وجود دارد که این میزان حدود 7/1 درصد از کل ژنوم انسانی است. 90 مورد از این تعداد شامل تیروزین کینازها هستند که نقش اصلی در پیام رسانی داخل سلولی ایفا می کنند. علاوه براین تیروزین کینازها مهم ترین گروه خانواده ی کینازها هستند که در بیولوژی سرطان مورد مطالعه قرار گرفته اند. این 90 تیروزین کیناز در انسان به دو گروه عمده تقسیم می شوند. گروه اول گیرنده های تیروزین کینازی متصل به غشا هستند و شامل 58 مورد می شوند و گروه دیگر تیروزین کینازهای سیتوپلاسمی هستند که گیرنده نیستند، این گروه شامل 32 مورد می شود. گیرنده های تیروزین کیناز براساس ساختار ناحیه ی خارج سلولی شان به 20 خانواده تقسیم می شوند (شکل6). همچنین گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده ی گیرنده های تیروزین کینازی است (21).
شکل6: دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی. گیرنده های تیروزین کیناز براساس ساختار ناحیه ی خارج سلولی شان به 20 خانواده تقسیم می شوند. هر گیرنده سه ناحیه دارد. ناحیه خارج سلولی، ناحیه گذرنده از غشا و ناحیه کینازی داخل سیتوپلاسمی. گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در دسته چهارم این خانواده قرار دارند.
2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی
فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGF) یک ناحیه‏ی هسته‏ای همولوگ دارند که شامل 120 الی 130 اسیدآمینه است. این ناحیه از کنار هم قرار گرفتن 12 رشته‏ی β ناهمسو (آنتی‏پارالل) (β1-β12) تشکیل شده است (شکل7). محل اتصال هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان (HSGAG) در ناحیه هسته‏ای پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست، متشکل از حلقه β1-β2 و قطعاتی از منطقه دربرگیرنده‏ی β10 و β12 است. یک واحد عملکردی کمپلکس FGF-FGFR متشکل از دو کمپلکس FGF-FGFR-HSGAG با نسبت 1: 1: 1 است که به صورت دایمر متقارن کنار یکدیگر قرار می گیرند. در این دایمر هر لیگاند به طور هم زمان به هر دو گیرنده متصل می شود و هر دو گیرنده نیز با یکدیگر در ناحیه D2 به طور مستقیم در تماس هستند. ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b در شکل 8 نشان داه شده است. هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان متصل به انتهای دیستال غشایی دایمر، موجب تقویت اتصال پروتئین-پروتئین می‏شود. این نواحی علاوه برتسهیل اتصال FGF-FGFR، موجب تثبیت پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست در برابر تجزیه می‏شوند و به عنوان یک مخزن ذخیره سازی لیگاند عمل می‏کنند. این نواحی هم چنین شعاع انتشار لیگاند را تعیین می‏کنند.
علاوه براین ناحیه دیگری به نام پروتئین اتصالی به فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGFBP) که یک پروتئین حامل است می تواند پروتئین‏های فاکتورهای رشد فیبروبلاست را از طریق آزادسازی آن‏ها از ماتریس خارج سلولی، یعنی در جایی که آن‏ها توسط اتصال به هپاران سولفات گلیکوزآمینوگلیکان محدود شده‏اند فعال سازد. مشاهده شده است که پروتئین اتصالی موجب افزایش تکثیر سلول‏های فیبروبلاست وابسته به FGF2 می‏شود و یک نقش مهمی در پیشرفت بعضی از سرطان‏ها دارد (22).
شکل7: ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست. 12 رشته‏ی β ناهمسو (آنتی‏پارالل) (β1-β12) و همچنین دو انتهای کربوکسیلی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 1، نشان داده شده است.
شکل8: ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b. ناحیه اتصال فاکتور رشد فیبروبلاستی 10 به نواحی قسمت خارج سلولی گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی 2b در شکل نشان داده شده است.
2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی
فاکتورهای رشد فیبروبلاست پستانداران (FGFs) شامل خانواده‏ای از 18 عضو (FGF1–FGF10) و (FGF16–FGF23) هستند. این فاکتورها از طریق چهار گیرنده تیروزین کینازی (FGFR1-4) و ایزوفرم‏های آن‏ها پیام سلولی ایجاد می‏کنند و از این طریق رشد و نمو جنین و سوخت و ساز بدن بزرگسالان را تنظیم می کنند. انتقال پیام کنترل نشده فاکتور رشد فیبروبلاست می‏تواند منجر به بدخیمی‏های انسانی شود. پروتئین‏های گیرنده ی فاکتور رشد

فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کیناز (RTK) هستند و همه آن‏ها یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی با خاصیت تیروزین کینازی دارند. قسمت خارج سلولی یک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی اولیه شامل سه ناحیه (Domain) شبه ایمونوگلوبولین (Ig) ،(D1، D2 و D3) است که توسط اتصال‏دهنده های انعطاف‏پذیر به یکدیگر متصل شده‏اند. از ویژگی‏های منحصر به فرد گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی وجود توالی‏ غنی از گلوتامات، آسپارتات، سرین درناحیه‏ی اتصال D2-D1 است که جعبه AB1 نامیده می‏شوند. موقعیت رزیجوهای تیروزین، جعبه اسیدی و هم چنین نواحی شبه ایمونوگلوبولین گیرنده در شکل 9 نشان داه شده است (23-21). هم چنین دو مکان اتصال برای فاکتور رشد فیبروبلاست، یک مکان اتصال به هپارین، و یک سایت تعامل گیرنده–گیرنده در D2 و D3 این گیرنده‏ها شناسایی شده است. اتصال مولکول‏های فاکتور رشد فیبروبلاست به گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی باعث جفت شدن (دایمریزیشن) گیرنده و به دنبال آن ترانس فسفریلیشن تیروزین موجود در حلقه‏ی فعال‏سازی ناحیه کینازی می‏شود. متعاقب آن قسمت انتهای کربوکسیل (COOH-terminal tail) گیرنده فسفریله می‏شود. در نتیجه گیرنده فعال شده و پروتئین‏های داخل سلولی مثل FRS2 (FGFR substrate2) را نیز فسفریله و فعال می کند. در نهایت شبکه‏ی انتقال پیام (سیگنالینگ) داخل سلولی القاء می‏شود که فرآیندهای بیولوژیکی کلیدی مانند تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز را به طور دقیق تنظیم می‏کنند (25-23).
در مجموع هفت گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی اصلی شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 داخل سلول وجود دارد. ایزوفرم b معمولاً در بافت اپی‏تلیال بیان می‏شود در حالی که ایزوفرم c معمولا در بافت مزانشیمی بیان می‏شود. لیگاندها در هر دو بافت اپی‏تلیال و مزانشیمی تولید می‏شوند و به طور کلی گیرنده‏های بافت مخالف خاص خود را فعال می‏کنند. در شرایط فیزیولوژیکی طبیعی یک لیگاند تولید شده در اپی‏تلیوم، گیرنده مزانشیمی را فعال می‏کند و برعکس. در وضعیت‏های پاتولوژیک این اتصال اختصاصی لیگاند و گیرنده از بین می‏رود که این امر در سرطان‏هایی شایع است که بیان بیش از اندازه‏ی پروتئین‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی در آن‏ها مشاهده می‏شود (27-26).
شکل9: گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن. موقعیت ریشه های تیروزین روی بخش داخل سلولی گیرنده نشان داده شده است. نواحی شبه ایمونوگلوبولین D1, D2, D3 در قسمت خارج سلولی گیرنده و ناحیه جعبه اسیدی در شکل نشان داده شده است.
2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی
عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینگ) گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط است، مانند سندرم‏های اسکلتی از جمله سندرم کروزون و سندرم فایفر که به دلیل جهش در ناحیه کینازی پروتئین FGFR2 ایجاد می‏شوند (28)، سندرم کالمن که می‏توان آن را به جهش در FGFR1 نسبت داد (29). سندرم LADDکه به دلیل کاهش عملکرد ناحیه کینازی FGFR2 و FGFR3 ایجاد می‏شود (30) و نیز برخی از سرطان‏ها. در سرطان‏های انسانی پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی توسط مکانیسم‏های مختلف نامنظم می‏شوند از جمله بیان نابجا، جهش، امپلیفیکیشن و بازآرایی‏های کروموزومی. چندین تغییر ژنتیکی و جهش درون خانواده‏ی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی شناسایی شده‏اند. تغییرات ژنتیکی که فنوتیپ سرطانی را ایجاد می‏کنند شامل جهش حذفی، جهش افزایش عملکرد، جهش ازدست دادن عملکرد و امپلیفیکیشن است (31). فرم‏های جهش یافته‏ی پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی در سرطان‏های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است (33-32). جهش‏های افزایش عملکرد در پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی مسئول بیماری‏های مختلف از جمله کرانیوستوزیس ، سندرم کوتولگی و برخی از سرطان‏ها است. اغلب جهش‏ها در پروتئین‏های گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی مستقل از لیگاند هستند اما در بعضی موارد مانند Ser252Trp و Pro253Arg در اکتودومین مولکول FGFR2 تنها در هنگام اتصال لیگاند اثرشان ظاهر می‏شود. این جهش‏ها باعث سندرم آپرت از طریق افزایش تمایل اتصال لیگاند و از طرفی بالا رفتن میزان اتصال نامناسب لیگاندها به گیرنده‏های خود می‏شود (34). جهش‏های ناحیه ی گذرنده از غشا، مانند Gly380Arg در FGFR3، اینتراکشن غیرکوالانسی بین هلیکس های گذرنده از غشا را زیاد می‏کند و تقریباً در همه‏ی موارد آکنودروپلازیا که شایع‏ترین فرم ژنتیکی کوتولگی است دیده می‏شود (35). جهش‏هایی که منجر به بیان بیش از اندازه و افزایش عملکرد FGFR3می‏شوند در مولتیپل میلوما که یک بدخیمی غیرقابل درمان سلول‏های B است رخ می‏دهد (36).FGFR4 ارزش بالقوه‏ای به عنوان یک مارکر پیش‏آگهی در سرطان دارد. Arg388 در FGFR4 با افزایش پیش‏روی سرطان پروستات مرتبط است، این پروتئین با افزایش تحرک و تهاجم سلولی موجب افزایش متاستاز می‏شود(37). برخی از این بیماریها و جهش ها ی نقطه ای به همراه اختلالات پاتولوژیکی مربوطه در شکل 10 نشان داده شده اند.
الف)
ب)
ج)
شکل10: برخی از بیماری ها (الف و ب) و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی(ج). این جهش ها در نواحی مختلف خارج سلولی، ناحیه گذرنده از غشا و ناحیه کینازی گیرنده های FGFR1,2,3 به همراه اختلال پاتولوژیکی مرتبط با جهش مورد نظر با علامت فلش در شکل مشخص شده اند.
2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی
با اتصال فاکتورهای رشد فیبروبلاستی به گیرنده های آنها، مسیر پیام رسانی FGF آغاز می شود. هپارین موجود در ماتریکس خارج سلولی و یا پروتئوگلیکان هایی که در سطح سلول حضور دارند این اتصال را تسهیل می کنند. به دنبال این اتصال دایمریزیشن گیرنده رخ می دهد و متعاقب آن تیروزین های موجود در خود گیرنده توسط ناحیه ی کینازی آن فسفریله می شوند، این فرآیند اتوفسفریلیشن نامیده میشود. همچنین فسفریله شدن ناحیه داخل سلولی محل مناسبی را برای اتصال مولکول های پایین دست گیرنده نظیر فسفولیپاز Cγ و نیز Src کینازها فراهم می کند. مولکول دیگری که فسفریله و فعال میشود، سوبسترای دوم گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی یا (FRS2) می باشد (شکل11). از طریق این مولکول ها سه مسیر متفاوت زیر فعال می گردند (38).
شکل11: مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی. فسفولیپاز Cγ و سوبسترای دوم گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی یا (FRS2) به عنوان دو مولکول هدف داخل سلولی اصلی برای این گیرنده ها در شکل نشان داده شده است. با اتصال فاکتورهای رشد فیبروبلاستی به گیرنده های آن، مسیر پیام رسانی FGF آغاز می شود. به دنبال این اتصال دایمریزیشن و متعاقب آن اتوفسفریلیشن گیرنده رخ می دهد، سپس با اتصال مولکول های پایین دست گیرنده فسفولیپاز Cγ، نظیر Src کینازها و (FRS2) پیام داخل سلولی ایجاد می شود.
2-1-6-1- مسیر Ras/MAP Kinase
یکی از مولکولهای مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاست، داکینگ مولکول FRS2 می باشد (39). نقش این مولکول کنار هم قرار دادن پروتئین ها برای هر دو مسیر MAP کیناز و PI3 کیناز می باشد (40). پس از فعال شدن گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاست، ناحیه تیروزین کیناز این گیرنده، ریشه ی تیروزین موجود در FRS2 را فسفریله می کند. این مراحل محلی مناسب برای اتصال مولکول های آداپتور نظیر (GRB2) فراهم می کند. خود مولکول (GRB2) شامل نواحی (SH3) یا (PTP) می باشد (41). هم چنین مولکول (SOS) از طریق ناحیه ی (SH3) به مولکول (GRB2) متصل می شود. مولکول SOS یک فاکتور تبادل نوکلئوتید گوانین است که پس از تشکیل کمپلکس با GRB2 قادر است مولکول Ras را فعال کند. فعال شدن Ras توسط SOS با تعویض GDP با GTP صورت می پذیرد. با فعال شدن Ras این مولکول قادر است با افکتور پروتئین هایی نظیر Raf برهم کنش دهد و بدین ترتیب آبشار مسیر پیام رسانی MAP کیناز فعال می گردد. این مسیر درچرخه سلولی نقش دارد و فعالیت های بیولوژیکی نظیر بقا، مهاجرت، تکثیر و مرگ سلولی را موجب می شود (43-42)(شکل 12).
شکل 12: مسیر پیام رسانی .Ras/MAP Kinase
2-1-6-2- مسیر PLCγ/Ca2+
پس از فسفریله شدن ناحیه داخل سلولی گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی، مولکول فسفولیپاز Cγ به تیروزین فسفریله شده ریشه ی 766 در FGFR1متصل می گردد و توسط ناحیه ی تیروزین کینازی گیرنده فسفریله می شود (44). در واقع نقش مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی در فعال شدن مسیر PLCγ/Ca2+ از طریق ایجاد جهش های خاص در گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی مشخص گردیده است. زمانی که PLCγ فعال می شود قادر است فسفاتیدیل اینوزیتول 4و5 دی فسفات را به دو مولکول دی آسیل گلیسرول (DAG) و نیز اینوزیتول 1و4و5 تری فسفات (IP3) هیدرولیز کند. هردو این مولکول های پیام رسان ثانویه در تنظیم غلظت کلسیم داخل سلولی نقش دارند. مولکول DAG پروتئین کیناز C را فعال می کند و IP3 تنظیم کلسیم داخل سلولی را بر عهده دارد (45) (شکل 13).
شکل 13: مسیر پیام رسانی PLCγ/Ca2+.
2-1-6-3- مسیر PI3 Kinase/Akt
این مسیر از طریق سه مکانیسمی که در مسیر پایین دست گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی قرار دارند فعال می شود. این مسیر یا میتواند به طور مستقیم توسط گیرنده و یا به طور غیر مستقیم از طریق Gab1 و یا Rasفعال گردد. هم چنین Akt یا پروتئین کیناز Bتوسط PI3 کیناز فعال می شود. در اغلب موارد در مراحل رشد و توسعه سلولی دو مسیر PI3 kinase/ Akt و Ras/MAP کیناز به موازات یکدیگر عمل میکنند (46) (شکل 14).
شکل 14: مسیر پیام رسانی PI3 Kinase/Akt.
2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی
مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی توسط یکسری سیگنال های مثبت و منفی تنظیم می شود. بسیاری از این سیگنال های تنظیمی بین تمام گیرنده های تیروزین کیناز مشترک است و بسیاری نیز خاص مسیر پیام رسانی فاکتور رشد فیبروبلاستی است (47). همچنین فاکتور رشد فیبروبلاستی بیان بعضی از مولکول های تنظیمی خود را تحت کنترل دارد، درنتیجه بسیاری از آن ها به طور هم زمان با فاکتور رشد فیبروبلاستی بیان می شوند (48).
این تنظیمات در سطوح مختلف سلولی نظیر سطح خارج سلولی، سطح گذرنده از غشاء و سطح داخل سلولی رخ می دهد. در سطح خارج سلولی هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها نقش مهمی را در تنظیم تعامل بین فاکتور رشد فیبروبلاستی و گیرنده بازی می کنند. هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها عبارتند از گلیکوزآمینوگلیکان های سولفاته که به طور کووالانسی به پروتئین اصلی متصل شده اند و یک ساختار بسیار متنوع را بر مبنای توالی گلیکوزآمینوگلیکان های خود تشکیل می دهند (49). به منظور شکل گیری مطلوب تر این ساختار از تعامل بین فاکتور رشد فیبروبلاستی وگیرنده، لازم است که ترانسفرازهایی نظیر گلیکوزیل ترانسفراز و نیز سولفوترانسفراز قندی تغییراتی از نظر موقعیت فضایی و زمانی در هپارین سولفات پروتئوگلیکان ها ایجاد کنند (50). همچنین این مولکول ها قادرند از دناتوراسیون حرارتی فاکتور رشد فیبروبلاستی، پروتئولیز و نیز جلوگیری از انتشار آن ها به فضاهای میان بافتی محافظت کنند (51). درسطح تنظیمی بعدی یعنی سطح گذرنده از غشاء، پروتئین های تنظیمی زیادی تشخیص داده نشده اند. یک

سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD، FTIR
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع
1-1- مقدمه
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی
فاکتور رشد فیبروبلاستی یا FGF (شکل 1) پروتئینی است که در بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر تقسیم سلولی، تکوین جنین، رگ زایی و بسیاری از فرآیندهای دیگر نقش دارد. به علاوه، این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم به محیط کشت سلولهای بنیادی جنینی انسانی اضافه می شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنیادینگی و بدون تمایز حفظ و تکثیر کرد (1).
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست
گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست(FGFR) در مسیر پیام رسانی سلول نقش کلیدی درتنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می کنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی و توسعه ی مراحل جنینی از جمله وظایفی هستند که در دوران جنینی و بزرگسالی در بدن توسط این گیرنده ها با اتصال به فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرم های موتاسیون یافته ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در سرطان های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.
شکل 1: نحوه عملکرد کلی FGF و .FGFR
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2
پروتئین نوترکیب FGFR2b (شکل2) متعلق به خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGFR) است. این پروتئین دارای 334 اسید آمینه و وزن مولکولی تقریبی 38 کیلودالتون می باشد. تغییرات ژنتیکی در این گیرنده با سرطان های اندومتریال، تخمدان و پستان در ارتباط می باشد. قابل ذکر است که نوع جهش یافته این گیرنده در تعدادی از سرطان ها گزارش شده است که با افزایش پیام مرتبط با این گیرنده در ارتباط می باشد(7).
در این پروتئین نوترکیب با انتقال الگوی موتاسیون مشاهده شده در گیرنده بیان شده در سلول سرطانی، فرم فعال و نوترکیب ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین FGFR2b ایجاد شده است که دارای جهش های مورد نظر می باشد. قابل ذکر است که تهیه ی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئینFGFR2b به صورت خالص این امکان را فراهم می کند که در مطالعات بعدی بتوان اطلاعاتی راجع به ساختار و نیز بررسی برهمکنش پروتئین و لیگاند از جمله اثر مهارکننده های مختلف را روی ناحیه ی کینازی این پروتئین به دست آورد.
بر این اساس در این تحقیق، تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش با فلزاتی که ذکر می شود، بررسی می گردد.
شکل 2: گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2.
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی
گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کینازی (شکل 3) هستند. این گیرنده ها دارای دو ایزو فرم b و cمی باشند که هرکدام به ترتیب در بافت های اپی تلیال و مزانشیمال بیان می شوند. هم چنین هفت گیرنده‏ در خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (شکل3) جای می گیرد که شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 می‏باشد(8). این گیرنده ها در مسیر پیام‏رسانی سلول نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می‏کنند (9). همه آن‏ها دارای یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی که خاصیت تیروزین کینازی دارد هستند. گیرنده ی FGFR2b ایزوفرم اپی تلیال گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی است. ناحیه ی کینازی FGFR2b متشکل از 334 اسیدآمینه می باشد و دارای ساختار به صورت دو ناحیه ی کینازی N-terminal و C-terminal است که توسط یک ناحیه ی اتصال دهنده انعطاف پذیر به هم مرتبط می شوند. این ناحیه ی اتصال دهنده حلقه ی فعال سازی نیز نامیده می شود که در عملکرد فسفریلاسیون تیروزین های ناحیه ی کیناز ی گیرنده نقش مهمی دارد. تقریبا %20 ژن‏های انسانی محصولاتی را کد می‏کنند که در مسیرهای پیام‏رسانی (سیگنالینگ) سلولی مشارکت دارند. تنظیم‏کننده‏های اصلی این مسیرها از طریق واکنش‏های فسفریلاسیون/ دفسفریلاسیون عمل می‏نمایند. آنزیم‏های تیروزین کیناز دسته‏ای از آنزیم‏ها هستند که مسئول فسفریلاسیون اسیدآمینه تیروزین روی پروتئین هدف خود هستند. دو خانواده از آنزیم‏های تیروزین کیناز وجود دارد که عبارتند از گیرنده های کینازی متصل به غشاء و کینازهای سیتوپلاسمی که گیرنده نیستند. ناحیه کاتالیتیکی از تیروزین کیناز شامل مکان اتصال به مولکول ATP ویژه و مکان اتصال به سوبسترا است (10).
الف)
ب)
شکل 3: الف) ساختمان کلی RTK. ب) انواع FGFR.
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون
جهش‏های نقطه‏ای در نواحی خارج سلولی، داخل غشایی و داخل سیتوپلاسمی باعث دایمریزیشن و یا اتوفسفریلیشن بدون ایجاد اتصال بین لیگاند و گیرنده می‏شوند. فعال‏سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون باعث فعالیت کینازی مداوم این آنزیم‏ها می‏شود. مکانیسم‏هایی که این موتاژنز آنزیمی را ایجاد می‏کنند شامل ترانس لوکشن کروموزومی یا موتاسیون های نقطه‏ای است که سبب تغییر در نواحی خارج سلولی، تغییر در ناحیه اتصال به ATP و تغییر در بخش کاتالیتیکی کیناز است. همه‏ی کینازها در فرم فعال از نظر کنفورماسیون شباهت زیادی با هم دارند در حالی که در فرم‏های غیر فعال از نظر ساختاری با یکدیگر متفاوت‏اند. آنکوژنیک تیروزین کینازها تنظیم فرآیندهای سلولی را مختل و یک فنوتیپ پاتولوژیک ایجاد می‏کنند، بنابراین به نظر می‏رسد که این پروتئین‏ها به عنوان یک هدف درمانی جالب توجه برای درمان سرطان باشند (11).
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق
درمطالعات انجام گرفته چندین جهش افزایش انتقال پیام در ناحیه ی کینازی FGFR2b در سرطان‏های اندومتریال، تخمدان و پستان شناسایی گردیده است. هم چنین مشخص شده است که اختلال تنظیمی مسیر پیام‏رسانی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی که می‏تواند ناشی از تغییرات ژنتیکی باشد با ایجاد سرطان ارتباط تنگاتنگی دارد (12). طبق مطالعات صورت گرفته، برخی فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، می توانند سبب اختلال در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و در نتیجه بروز بیماریهای متعددی شوند. یکی از سازوکارهایی که در ارتباط با اثر این ترکیبات روی رشد سلول‏های سرطانی مطرح می‏باشد اثر این ترکیبات بر روی مسیر انتقال پیام با واسطه تیروزین فسفریلاسیون می‏باشد (15-13). طبق دانش ما تاکنون برهمکنش FGFR2b KD با فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، در مطالعه ای گزارش نشده است. بر این اساس در این مطالعه تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b KD بر اثر برهمکنش با سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم با کمک تکنیک های اسپکتروسکوپی شامل فلوئورسانس، CD و FTIR بررسی می‏گردد.
1-3- اهداف طرح
1-3-1- هدف اصلی
بررسی بیان و تخلیص ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-2- اهداف فرعی
بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli.
تخلیص پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی.
بررسی تغییرات ساختاری پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-3- اهداف کاربردی
مشخص شدن عوامل موثر در تغیییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان برخی سرطان ها و بیماری ها موثر باشد.
1-3-4- فرضیات
پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli بیان می شود.
پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص می شود.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با سرب تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با کادمیوم تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با نیکل تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با آلومینیوم تغییر می‏کند.
1-3-5- متغییرها
عنوان متغیر
مستقل
وابسته
کمی
کیفی
تعریف علمی
مقیاس
پیوسته
گسسته
اسمی
رتبه ای
بیان پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
غلظت پروتئین
mg/ml
فلزات سمی
*
*
ppb
بررسی تغییر ساختار سوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک فلوئورسانس تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
Flourescence Intensity
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک پولاریزه تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
CD Spectropolarimeter
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک اسپکترومتر تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
FTIR
cm-1
جدول 1: جدول متغیرها. متغیرهای مورد آزمایش، تعریف علمی هریک و مقیاس اندازه گیری آن ها.
فصل دوم مروری بر متون گذشته
2-1- پروتئین
پروتئینها ماکرومولکول هایی هستند که تمام اعمال مهم در ارگانیسم ها را انجام می دهند، از جمله این اعمال انجام واکنشهای بیوشیمیایی، انتقال مواد غذایی، تشخیص و انتقال پیامها است. بنابراین ژنها خزانه اطلاعات و پروتئینها ماشینهای حیات می باشند. پروتئینها از بهم پیوستن اسیدهای آمینه توسط پیوندهای پپتیدی به صورت یک زنجیره بوجود می آیند. پروتئینها از نظر طول زنجیره (از 30 تا بیش از 000/30 اسید آمینه) و همچنین ترتیب قرار گرفتن اسیدهای آمینه با هم متفاوت هستند.
پروتئین هایی که ما در طبیعت مشاهده می کنیم از طریق انتخاب طبیعی تکامل یافته اند تا عملی خاص را انجام دهند. عملکرد پروتئین ها به ساختار فضایی آنها بستگی دارد. اسیدهای آمینه که با ترتیبی خاص کنار هم قرار گرفته اند (ساختار اول) با پیچ و تاب خوردن در رو و کنار یکدیگر زیر واحدهایی را می سازند (ساختار دوم) که با استفاده از آنها ساختار فضایی پروتئین ساخته می شود(ساختار سوم) و حتی گاه چند واحد این چنینی با قرار گرفتن در کنار هم، خود ساختمان عظیم تری(ساختمان چهارم) را بوجود می آورند.
ساختمان پروتئین ها بطور تجربی بوسیله تکنیک های بلور نگاری پرتوی ایکس و رزنانس مغناطیسی هسته تعیین می شود. در طول 30 سال گذشته ساختمان بیش از 14000 پروتئین شناخته شده است و توالی بیش از 600000 پروتئین مشخص شده است. این موضوع حجم زیادی از اطلاعات را فراهم آورده است که می توان با استفاده از آنها اصول بنیادی ساختمان پروتئین ها را استنتاج کرد. این اصول درک چگونگی ایجاد ساختمان پروتئین ها، رابطه ساختمان و عمل و اساس ارتباط خویشاوندی بین پروتئین ها را آسان کرده است. علم ساختمان پروتئین در مرحله شناسایی و طبقه بندی است که در این مرحله ما میتوانیم اجزای شاخص و الگوها را در پروتئین هایی که ساختمان سه بعدی آنها تعیین شده است مشخص کنیم(17-16).
پروتئینها مواد آلی بزرگ و یکی از انواع درشت ‌مولکول‌های زیستی هستند که از زیر واحدهایی به نام اسید آمینه ساخته شده‌اند. پروتئین‌ها مانند زنجیری از یک کلاف سه‌بعدی هستند که از ترکیب اسیدهای آمینه حاصل می‌شوند. اسیدهای آمینه مثل یک زنجیر خطی توسط پیوند پپتیدی میان گروه‌های کربوکسیل و آمین مجاور ب

دانشگاه علوم پزشکی قزوین
فهرست شکل ها و جداول:
شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFR
شکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2
شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFR
شکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینه
شکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین
شکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی
شکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست
شکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b
شکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن
شکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی
شکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی
شکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPK
شکل 13 : مسیر پیام رسانی PLCy/Ca+2
شکل 14: مسیر پیام رسانی PI3-K/Akt
شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS
شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن
شکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز
شکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1
شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB
شکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T
شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1
شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز
شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ
شکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK
شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ
شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید
شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانین
شکل 28: دیاگرام جابلونسکی
شکل 29: دناتوراسیون پروتئین
شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید
شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا
شکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین
شکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01
شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون
شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین
شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی
شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)
شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810 Circular dichroism spectroscopy))
شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI
شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گراد
شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد
شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد
شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTA
شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز
شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده
شکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CD
شکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIR
شکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
شکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b
جدول 1: جدول متغیرها
جدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیک
جدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.
فهرست مطالب
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع 3
1-1- مقدمه 4
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی 4
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست 4
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2 5
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی 6
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون 8
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق 9
1-3- اهداف طرح 9
1-3-1- هدف اصلی 9
1-3-2- اهداف فرعی 9
1-3-3- اهداف کاربردی 10
1-3-4- فرضیات 10
1-3-5- متغییرها 10
فصل دوم مروری بر متون گذشته 11
2-1- پروتئین 12
2-1-1- ساختمان پروتئین ها 13
2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی 17
2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 18
2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی 20
2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی 22
2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 25
2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی 29
2-2- فلز چیست؟ 31
2-2-1- فلزات سمی 31
2-2-3- سرب 32
2-2-4-کادمیوم 32
2-2-5- نیکل 33
2-2-6-آلومینیوم 33
2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ 34
2-7-1-ROS 34
2-7-2- MAPK 35
2-7-3- PI3K/Akt 36
2-7-4- HIF 37
2-7-5- NF-kB 38
2-7-6- NFAT 39
2-7-7- AP 40
2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 41
2-8-1- سرب 41
2-8-2- کادمیوم 43
2-8-3- نیکل 46
2-8-4- آلومینیوم 48
2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها 50
2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 50
2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 51
2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها 52
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی 53
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 56
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون 57
2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب 60
2-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب 60
2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 60
2-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان 63
2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین 64
2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب 64
فصل سوم مواد و روش ها 66
3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش 67
3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش 67
3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش 68
3-2- محلول ها و بافرها 69
3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین 69
3-2-2- تهیه ی استوک IPTG 70
3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین 70
3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین 70
3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4% 70
3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12% 71
3-2-7- تهیه ی محلول APS10% 71
3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer) 71
3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 71
3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار 72
3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار 72
3-2-12- تهیه ی Staining Buffer 72
3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 73
3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 73
3-2-15- تهیه بافر SDS 73
3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 73
3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer 74
3-2-18- تهیه بافر دیالیز 74
3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 74
3-2-20- تهیه استوک فلزات 74
3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری 74
3-3- روش انجام کار 75
3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 75
3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب 77
3-3-3- تعیین غلظت پروتئین 83
3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 83
3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 85
3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR 86
3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 87
فصل چهارم یافته ها و نتایج 88
4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد 88
4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد 89
4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد 90
4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 91
4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 92
4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 93
4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 94
4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 98
4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 101
4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104
فصل پنجم بحث و نتیجه گیری 109
5-1- بحث و نتیجه گیری 110
فهرست منابع: 116
….………………………………………………………………………………..Abstract125
چکیده
زمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند. عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFR با بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است. از این گروه گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیام‏رسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.
هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.
یافته‏ها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.
بحث و نتیجه‏گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه‏ کینازی گیرنده‏ نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی 2b که یک پروتئین 38 کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.
کلیدواژه‏ها: گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی،

بذوری مشاهده شد که در سطح شوری صفر میلی‌مول در لیتر قرار داشتند و مقدار آن برابر بود با 78/9 میلی‌گرم قند احیایی در یک گرم بذر که البته تفاوت معنی داری با سطح شوری 50 میلی‌مول بر لیتر نداشت. کمترین میزان قند احیایی در سطح شوری 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام مشاهده شد که میزان آن 95/7 میلیگرم در یک گرم بذر بوده است.
نمودار 4-12 اثر شوری بر روی میزان قند احیایی
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد تأثیر ماده شیمیایی بر روی قند احیایی در بذر همانطور که در نمودار 4-13نشان داده شده، بالاترین میزان قند احیایی در زمانی مشاهده شده که بذور تحت تأثیر جیبرلیک اسید پرایمینگ قرار داشتند و مقدار آن برابر بود با 15/10 میلی‌گرم قند احیایی در یک گرم بذر اما این تیمار با بذوری که تحت تأثیر پرایمینگ قرار نداشتند از نظر میزان قند‌های احیایی تفاوت معنی داری نداشتند. کمترین میزان

(C)
94/4*
26/3*
**87/6
20
AB
**56/10
**14/4
**07/12
10
AC
**74/82
**73/19
**06/161
8
BC
**28/9
**78/3
**47/9
40
ABC
50/2
74/1
92/1
180
خطای آزمایش
05/26
06/15
34/9
CV
**معنی دار در سطح 1 درصد و*معنی دار در سطح 5 درصد
4-5 قند کل:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-9 تأثیر فاکتور پرایمینگ، شوری و فاکتور زمان همچنین تمامی اثرات متقابل آنها در سطح 1% اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند.
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد همان گونه که در نمودار 4-9 مشاهده می‌شود بالاترین میزان قند کل مربوط به سطح شوری 50 میلی‌مول در لیتر نمک طعام و کمترین میزان قند کل مربوط به سطح شوری 100میلی‌مول در لیتر نمک طعام می‌باشد.
نمودار 4-9: اثر شوری بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد فاکتور ماده شیمیایی باید بیان کرد که با توجه به نمودار 4-10 بالاترین میزان قند کل مربوط به تیمار پرایمینگ با سالسیلیک اسید بوده که برابر است با 06/18 و کمترین میزان قند کل مربوط به تیمار پرایمینگ با جیبرلیک اسید می‌باشد که میزان آن برابر بود با 5/12 میلیگرم قند کل در یک گرم بذر که این میزان حتی از بذور تیمار نشده کمتر بود.
نمودار 4-10: اثر پرایمینگ های مختلف بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
در مورد فاکتور زمان باید بیان شود که با مقایسه میانگین زمان‌های مختلف با آزمون دانکن بر طبق نمودار 4-11 بالاترین میزان قند کل مربوط به زمان 36 ساعت بود که میزان متوسط قند کل در این زمان برابر بود با 78/15 میلی گرم قند کل در یک گرم بذر و حداقل میزان قند کل مربوط بود به زمان 12 ساعت که مقدار آن برابر بود با 73/13 میلیگرم قند کل در یک گرم بذر. بر طبق این نمودار مشاهده می‌شود که با گذشت زمان بر میزان قندکل بذر افزوده گردیده است.
نمودار 4-11: اثر زمان بر روی میزان قند کل
*ستونهای دارای حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند (دانکن 5 درصد)
با توجه به جدول 4-10 که نشان دهنده مقایسه میانگین‌های اثر متقابل شوری و پرایمینگ بر مقدار قند کل می‌باشد مشاهده شد که بالاترین میزان قند کل زمانی بدست می‌آید که بذور تحت تیمار سلیسلیک اسید پرایمینگ قرار داشتند و میزان شوری نیز 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام بود که در این حالت مقدار آن برابر بود با 13/19 میلی‌گرم قندکل بر یک گرم بذر و حداقل مقدار قند کل زمانی حاصل گردید که بذور تحت هیچ گونه تیماری قرار نگرفته بودند و سطح شوری نیز 250 میلی‌مول در لیتر نمک طعام بوده است. میزان قند کل در این حالت 53/11 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-10 اثر متقابل شوری و پرایمینگ بر قند کل
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150
میلی‌مول
100
میلی‌مول
50
میلی‌مول
میلی‌مول
میزان شوری
پرایمینگ
53/11 k
53/12ijk
47/12 ijk
49/12ijk
08/13 g-j
09/14 e-h*
بدون پرایم
4/13 f-j
41/14efg
7/13 f-i
75/13 f-i
23/15 de
34/13 f-j
جیبرلیک اسید
59/12 h-k
38/12ijk
56/12 ijk
86/11jk
09/13 g-j
53/12ijk
آب
13/19 a
96/17ab
85/17ab
33/18ab
88/17ab
19/17bc
سالسیلیک اسید
81/17ab
92/15 cd
77/17ab
75/14 def
95/16bc
42/18ab
نمک طعام
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
با مشاهده جدول 4-11 که بیانگر مقایسه میانگین‌های اثرات متقابل پرایمینگ و زمان به روش دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد بالاترین میزان قند کل در حالتی بدست می‌آید که بذور تحت تیمار سالیسلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته و 36 ساعت از زمان شروع خیس کردن گذشته باشد. در این حالت میزان قند کل برابر بود با 7/22 میلی‌گرم قند کل به یک گرم بذر از سوی دیگر کمترین میزان قند کل نیز زمانی بدست آمد که بر روی بذور هیچ‌گونه تیماری صورت نگرفته بود و تنها 12 ساعت از شروع خیس کردن بذور گذشته باشد که میزان قند کل بذر در این حالت 84/13 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-11 اثر متقابل پرایمینگ و زمان بر قند کل
نمک طعام
سالسیلیک اسید
آب
جیبرلیک اسید
بدون پرایم
پرایمینگ
ساعت
پس از
خیس شدن بذر
1/13ef
42/13ef
30/11 g
99/16 d
84/13 e*
12 ساعت
86/17 cd
48/18 c
37/13ef
19/13ef
58/11 g
24 ساعت
84/19 b
27/22 a
84/12ef
74/11 g
67/12 f
36 ساعت
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
اثر متقابل دیگری که باید با آن توجه شود اثر متقابل شوری و زمان می‌باشد بر طبق جدول 4-12 که نشان دهنده مقایسه میانگین این اثر متقابل می‌باشد بالا ترین مقدار قند کل در زمانی بدست آمد که بذور تحت تنش شوری نبودند یعنی در زمانی که از آب مقطر جهت آب دهی به بذور استفاده شده و در زمان 36 ساعت پس از خیس کردن بذور در این مورد میزان قند کل بذر 35/17 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر بود. کمترین میزان قند کل نیز در حالتی مشاهده شد که بذور تحت تنش شوری 100 میلی‌مول نمک طعام در لیتر قرار داشتند و تنها 12 ساعت از شروع خیس شدن بذرها می‌گذشت در این حالت میزان قند کل در بذور برابر بود با 38/13 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر می‌باشد.
جدول4-12 اثر متقابل شوری و زمان بر قند کل
250
میلی‌مول
200
میلی‌مول
150 میلی‌مول
100 میلی‌مول
50
میلی مول
میلی‌مول
میزان شوری
ساعت
پس از
خیس شدن بذر
46/13ef
05/14 def
31/13 f
38/13ef
04/14 def
13/14 def*
12 ساعت
72/14 cd
5/14cde
40/15bc
48/15bc
42/15bc
86/13 def
24 ساعت
5/16ab
37/15bc
90/15 b
84/13 def
27/16 b
35/17 a
36 ساعت
*میانگین‌های با حروف مشابه اختلاف معنی داری ندارند ( دانکن 5% )
در نهایت در مورد اثر سه جانبه زمان، شوری و پرایمینگ باید گفته شود که بر اساس جدول 4-13 بیشترین میزان قند زمانی حاصل گردید که بذور تحت تنش شوری 250 میلی‌مول بر لیتر نمک طعام بودند و تیمار سالسیلیک اسید پرایمینگ بر روی آنها انجام شده بود همچنین 36 ساعت از زمان خیس شدن بذور می‌گذشت در این حالت میزان قند کل بذور برابر بود با 38/26 میلی‌گرم قند کل در یک گرم بذر و کمترین مقدار قند کل نیز در زمانی بدست آمد که بذور تحت تنش شوری 100 میلی‌مول در لیتر نمک طعام قرار گرفته بودند و تیمار جیبرلیک اسید پرایمینگ بر روی آنها صورت گرفته بود همچنین تنها 12 ساعت از زمان خیس شدن بذور می‌گذشت در این حالت مقدار قند کل برابر بود با 36/10 میلی‌گرم قند کل بر یک گرم بذر.
جدول 4-13 اثر متقابل پرایمینگ، شوری و زمان بر روی قند کل
پرایمینگ
سطح شوری
ساعت پس از خیس شدن بذر
بدون پرایم
جیبرلیک اسید
آب
سالیسیلیک اسید
نمک طعام
12
23/14
4/17
18/11
63/13
22/14
24
29/12
07/12
26/13
59/15
09/16
36
75/15
56/10
15/13
35/22
94/14
50
12
06/14
84/19
7/11
12
62/12
50
24
37/11
82/12
66/14
07/19
18/19
50
36
8/13
03/13
92/12
57/22
04/19
100
12
89/13
73/16
36/10
16/13
77/12
100
24
80/10
62/12
44/13
74/20
83/19
100
36
80/12
9/11
78/11
09/21
64/11
150
12
66/13
92/15
87/11
28/13
82/11
150
24
86/11
34/14
26/13
92/18
62/18
150
36
9/11
85/10
54/12
35/21
86/22
200
12
22/14
84/15
63/11
67/15
89/12
200
24
22/12
69/14
9/11
31/18
37/15
200
36
14/11
7/12
61/13
9/19
51/19
250
12
13
22/16
04/11
77/12
27/14
250
24
96/10
61/12
7/13
24/18
08/18
250
36
62/10
38/11
03/13
38/26
07/21
در مورد فاکتور شوری باید اظهار داشت بر طبق گزارشات گیل و همکاران (2001) بذور سورگومی که تحت تنش شوری قرار گرفته بودند دارای سطوح بالاتری از قند کل نسبت به بذور شاهد بودند که این تأثیر تنها در سطح 50 میلی‌مول در لیتر قابل مشاهده بوده و در سطوح بالاتر شوری میزان قند کل نسبت به بذور تیمار نشده کاهش یافت. از سوی دیگر بر طق مشاهدات سیوریتیپ و همکاران (2003) سطوح قند کل در بذور گیاه هندوانه‌ای که در معرض تنش شوری قرار داشت به طور قابل توجهی کاهش یافت که این نتایج با نتایج تحقیق حاضر در یک راستا می‌باشند.در رابطه با تیمار هالوپرایمینگ بر طبق تحقیقات فرهودی و همکاران (2010) بر روی خربزه رقم تخم‌قند مشاهده شد که پیش‌تیمار سازی بوسیله نمک سبب افزایش میزان کربوهیدرات گردید است همچنین بر طبق گزارش سیوریتیپ و همکاران (2003) در گیاه طالبی پیش‌تیمارسازی بوسیله نمک سبب افزایش کربوهیدرات محلول گردیده است نتایج تحقیقات فوق با این تحقیق همراستا بوده و نشانگر این بود که تیمار هالوپرایمینگ سبب افزایش میزان قند کل نسبت به بذور تیمار نشده می‌گردد. بر طبق گزارش نوربخشیان و همکاران (2011) بذور گیاه اسپرسی که تحت تیمار هیدروپرایمنیگ قرار گرفته بود در شرایط تنش شوری دارای میزان بالاتری قندکل بودند در تحقیق حاضر فقط در بالاترین حالت تنش یعنی 250 میلی‌مول نمک طعام در لیتر افزایش مقدار قند کل در بذور گیاه ماریتیغال نسبت به بذور پرایم نشده مشاهده گردید. بنا بر گزارش سیوریتیپ و همکاران (2003) بذور هندوانه‌ای که تحت تیمار هالوپرایمینگ قرار گرفته بودند نسبت به بذور شاهد در تنش شوری دارای مقدار بالاتری قند کل بودند نتایج تحقیق فوق با تحقیق حاضر کاملاً در یک راستا بوده. در تحقیق حاضر در کلیه سطوح تنش شوری بذور ماریتیغالی که تحت تنش شوری قرار داشتند دارای میزان بالاتری قند کل نسبت به بذور تیمار نشده بودند. در تحقیقی که توسط حمید و همکاران (2008) بر روی بذور گندمی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید قرار گرفته بودند انجام شد مشاهده گردید که در شرایط تنش شوری این بذور دارای مقدار بالاتری قند کل نسبت به بذور شاهد بودند که نتیجه این تحقیق با تحقیق حاضر در یک راستا می‌باشد زیرا در تمامی سطوح شوری مقدار قندکل در بذور ماریتیغالی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته بودند از بذور پرایم نشده بالاتر بود. بنا بر گزارش کیم و همکاران بذور برنجی که تحت تیمار سالیسیلیک اسید پرایمینگ قرار گرفته بودند در شرایط تنش شوری دارای میزان بالاتری قند کل بودند بنابر نتایج تحقیق حاضر در تنش‌های بالاتر از 50 میلی‌مول نمک طعام در لیتر بذور ماریتیغالی که با جیبرلیک اسید پرایم شده بودند دارای سطوح بالاتر قند کل نسبت به بذور پرایم نشده بودند که نتایج هر دو تحقیق در یک راستا می‌باشند.
4-6 قند احیایی:
با توجه به جدول تجزیه واریانس شماره 4-9 تأثیر فاکتور ماده شیمایی و فاکتور شوری در سطح 1% معنی‌دار گردید اما اثر زمان بر روی میزان قندهای احیایی معنی دار نبود. همچنین اثر متقابل شوری و زمان نیز معنی دار نبود اما دیگر اثرات متقابل در سطح 1% معنی‌دار بودند.
با مقایسه میانگین‌های سطوح مختلف شوری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد همان گونه که در نمودار 4-12 مشاهده می‌شود بالاترین میزان قند احیایی در