سنتز، شناسایی کمپلکس¬های جدید دارویی از گالیم، قلع و تیتانیم و مطالعات کلینیکی تعدادی از آن¬ها در درمان برخی رده¬های سلول¬های سرطانی- قسمت ۷- قسمت 2

سنتز، شناسایی کمپلکس¬های جدید دارویی از گالیم، قلع و تیتانیم و مطالعات کلینیکی تعدادی از آن¬ها در درمان برخی رده¬های سلول¬های سرطانی- قسمت ۷- قسمت 2

جهت فریزکردن سلولها، سوسپانسیون سلولی باید ترجیحاً در غلظت زیاد و در حضور یک نگهدارنده مثل DMSO منجمد شود. این ماده، محافظ سرمایی میباشد که با کاهش نقطه انجماد، باعث کاهش سرعت منجمد شدن سلولها میشوند. همچنین منجمد شدن تدریجی، خطر تشکیل بلورهای یخ و در نتیجه آسیب سلولی را کاهش میدهد.
جهت فریز کردن سلولها، بعد از تریپسینهکردن آنها و تهیه سوسپانسیون سلولی، سلولهای تهنشین شده بر اثر سانتریفوژ شمارش شده و ml 1 از محیط فریز شامل FBS و ۱۰%DMSO به سلولها اضافه شد. سپس سوسپانسیون سلولی سریع به کرایوتیوب منتقل شد. کرایوتیوبها ۲۴ ساعت در۸۰- درجه سانتیگراد و سپس جهت نگهداری برای مدت طولانیتر به تانک ازت منتقل شدند.

 

۲-۴-۲-۳ دفریز کردن سلولها

 

عمل احیاء یا دفریز کردن باید بسیار سریع انجام گیرد. برای این منظور کرایوتیوب حاوی سلول از تانک ازت خارج و به مدت بسیار کوتاه در حمام آب گرم ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس ml 1 محیط کشت به سلولهای در حال ذوب اضافه شده و بعد از چند بار پیپتاژ سریع، قطره قطره از کناره دیواره به داخل لوله سانتریفوژ حاوی محیط کشت اضافه شد تا اثرات سمی DMSO بر سلولها خنثی شود. سپس میتوان یا بلافاصله به فلاسک منتقل کرد و ۲ تا ۳ ساعت در انکوباتور۳۷ درجه سانتیگراد و CO2 ۵% نگهداری کرد در طی این مدت، سلولها به کف فلاسک میچسبند و در این هنگام میتوان محیط رویی را که حاوی DMSO میباشد خالی کرد و دوباره محیط جدید درون فلاسک ریخت و یا سوسپانسیون سلولی ۱۰ دقیقه در g 380 سانتریفوژ شد، در نهایت محیط رویی خارج و به سلولها محیط کشت جدید اضافه شد. سوسپانسیون سلولی حاصل به فلاسک منتقل گردید.

 

۲-۴-۲-۴ انتخاب و جایگذاری سلولهای سرطانی مختلف در پلیت[۱۰۰]

 

برای بررسی اثر ترکیبات سنتز شده بر روی سلولهای سرطان سینه، از رده سلولی MCF-7، استفاده شد که ردهی سلولی وابسته به بستر[۱۰۱] میباشد. آمادهسازی فلاسک و قراردادن سلولها در پلیتهای ۹۶ خانه (کشت سلولی[۱۰۲]) به این صورت انجام شدکه ابتدا فلاسک سلولی محتوی سلولهای MCF-7 که سلولها قسمت زیادی ازکف آن را اشغال کرده بودند، تریپسینه شد. به این منظور محیط کشت فلاسک با پیپت استریل، برداشت شده و هر بار ۵/۰ تا ۵/۱ میلیلیتر تریپسین به فلاسک اضافه شد. پس از گذشت حدود ۱ دقیقه و زدن چند ضربه به دیواره ظرف،
بهمنظور خنثیکردن تریپسین، ۱ تا ۳ میلیلیتر محیط کشت (DMEM) به فلاسک افزوده شد (محیط کشت حاوی سرم است و در سرم، آنتیتریپسینها موجود میباشند). حال بعد از چند بار پیپتاژ و تکسلولیشدن سلولها به کمک پیپت cc 5 از سوسپانسیون حاصل به لام نئوبار منتقل شد. مشاهدهی سلولها در زیر میکروسکوپ نشان داد که سلولها، بهخوبی از هم جدا شدهاند (در غیر اینصورت سوسپانسیون باید چند بار دیگر سمپلر شود). سپس شمارش سلولی صورت گرفت. به این ترتیب که چهار مربع در چهار گوشه لام نئوبار شمارش شدند (مربع وسطی شمارش نشد) و میانگین آنها بهدست آمد. از ضربکردن این عدد در ۱۰۴ مقدار سلول در هر میلیلیتر از این سوسپانسیون مشخص شد.
با بستن تناسب بین مقدار سلولها در یک میلیلیتر و دانستن حجم سوسپانسیون سلولی مورد نیاز و نیز مقدار سلولی که باید در هر چاهک کشت داده شود، مقدار سلولی که میبایست از سوسپانسون اولیه برداشته شود، محاسبه شد. سوسپانسیون نهایی چند بار تکان دادهشد، سپس به یک قایقک استریل انتقال یافت و با کمک سمپلرهای ۸ کاناله، µl100 از آن به هر چاهک اضافه شد. در هر نوبت کشت سلولی، دو پلیت و در هر کدام ۹۶ خانه، کشت داده شدند. سپس پلیت را به انکوباتور CO2با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انتقال یافت. لازم به ذکر است تمامی مراحل گفته شده در شرایط استریل و زیرهود لامینار صورت گرفت. با شرایط کاملاً مشابه، برای بقیه رده های سلولی، عمل میشود.

 

۲-۵ بررسی اثرات سمیت سلولی به روش MTT

 

برای کنترل وضعیت سلولها در محیط کشت، میزان بقاء[۱۰۳] و همچنین بررسی وضعیت سلولها بعد از تیمارهای مختلف دارویی از روش های مختلفی استفاده میشود که یکی از این روشها تست MTT میباشد.
کمپلکسهای تهیهشده در این مطالعه، برای فعالیت ضدتوموری در برابر رده های سلولیHeLa (کارسینومای تخمدان انسانی)، MCF-7 (سرطان سینه انسانی)، HT-29 (سرطان روده بزرگ انسانی)، K-562 (سرطان سلول‌های میلوییدی خون انسان) و Neuro-2a (نوروبلاستوما موشی) بررسی و از سیس پلاتین بهعنوان داروی مرجع برای مقایسه استفاده شد. درصد میزان بقاء (زنده ماندن سلولها) با بهره گرفتن از یک روش رنگسنجی بر مبنای نمک تترازولیم MTT مورد بررسی قرار گرفت.اMTT که یک نمک تترازولیوم زرد رنگ است توسط آنزیم دهیدروژناز موجود در میتوکندری فعال سلولهای زنده، احیاء شده و به ترکیب بنفش رنگ فورمازان که کریستالی و نامحلول میباشد، تبدیل میگردد. سلولها در پلیتهای ۹۶ خانهای (چاهک) و به تعداد ۱۰۴   × ۵-۲ سلول از هر ردهی سلولی به ازای هر چاهک در μL100 از محیط کشت، کشت داده شدند و برای چسبندگی مطلوب بهمدت یک شب انکوبه شدند.
پس از حذف دقیق محیط کشت، μL 100 از محیط کشت تازه، اضافه شده و انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد و CO2 ۵% بهمدت ۷۲-۲۴ ساعت، انجام گرفت. سپس کمپلکسهای تهیه شده ابتدا در DMSO حل و سپس در محیط کشت، رقیق شده و در غلظتهای نهایی μM160-nM16 به سلولها اضافه میشوند. غلظت نهایی DMSO در محیط کشت در تمامی آزمونها کمتر از ۱% بود. سیس پلاتین ابتدا در محلول نمکی حل شده و سپس در همان غلظت استفاده شده برای کمپلکسها، به سلولها اضافه شد. سپس، انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد و CO2 ۵% بهمدت ۴۸ ساعت انجام گرفت. در پایان انکوباسیون، مقدار μL20 از محلول MTT (mg/ml 5 در بافر بیرنگ PBS) به چاهکها اضافه شد و پس از ۴-۳ ساعت انکوباسیون، محتوای چاهکها (محیط کشت) تخلیه شد. سپس در این مرحله، μL DMSO100 به عنوان حلال کریستالهای بنفش رنگ فورمازان (شکل ۲-۱) که در سیتوپلاسم سلولها ایجاد شدهاند، به هر چاهک افزوده شد. پلیت به مدت ۶ دقیقه با سرعت ۴۰۰ دور در دقیقه روی شیکر قرار گرفت تا کریستالهای فورمازان تشکیل شده، کاملاً درون DMSO حل شوند. سپس شدت رنگها، توسط دستگاه الیزا ریدر[۱۰۴] در طول موجnm 570 خوانده شد.
بعد از محاسبات مربوطه، IC50 نمونه ها برای زمان مورد نظر تعیین شد. از محیط کشت فاقد سلول، به عنوان بلانک دستگاه الیزا ریدر و از محیط کشت بههمراه سلول و بدون دارو، به عنوان کنترل سلول زنده استفاده شد. لذا سه چاهک شامل سلول و محیط کشت کامل، به عنوان کنترل در نظر گرفته شد و در سه چاهک، از داروی کنترل مثبت سیس پلاتین برای مقایسه با کمپلکسهای مورد مطالعه، استفاده شد. هر رقت در سه چاهک از پلیت سنجش گردید و برای هر رقت، سه بار تکرار در نظر گرفته شد [۱۰۴].
 

شکل۱-۲ : واکنش تبدیل MTT به فورمازان

 

 

۲-۵-۱ اندازه گیری IC50

 

نتیجهی مطالعات سمیت سلولی[۱۰۵] توسط کمیت IC50 نمایش داده میشود. این کمیت غلظت مادهی سمی (دارو) لازم برای کاهش رشد جمعیتی از سلولها تا به حد ۵۰ درصد نسبت به همان جمعیت در محیط کشت بدون ماده سمی تعریف میشود. مقدار IC50 به تغییر غلظت مادهی سمی در محیط کشت و مدت زمانی که سلول با آن در تماس بوده است وابسته میباشد [۱۰۵].

 

۲-۶ ارزیابی آپوپتوز برای کمپلکس بوسیلهی فلوسایتومتری

 

آپوپتوز یک شکل منفرد از مرگ سلولی است که در اغلب بافتها، تعداد سلولها را در طی نمو و نیز در انواع گسترده‌‌ای از شرایط پاتولوژیک و نرمال، کنترل مینماید. برای آپوپتوز، اصطلاحات دیگری نیز بکار می‌رود که عبارتند از: مرگ سلولی کنترل شده، مرگ سلولی فیزیولوژیک، مرگ سلولی بیولوژیک و مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده. از آنجایی که در مراحل اولیه آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین[۱۰۶] (که یک فسفولیپید غشایی است، باعث انعطافپذیری غشای سلولها میشود) از سطح داخلی غشاء پلاسمایی به سطح خارجی آن منتقل میشود و در آنجا برای رساندن پیام مرگ به سلولهای مجاور فاگوسیتهای عملکردی جهت بلعیدن سلول، عمل مینماید [۱۰۶]. در روشی جدید برای نشان دادن سلولهای آپوپتوزی، Annexin V که عضوی از خانوادهAnnexin است را بکار میبرند [۱۰۷]. در واقع Annexin با واسطه Ca2+ می‌تواند به فسفو لیپید متصل شود و برای نشان دادن سلولهای آپوپتوزی در محیطهای کشت و یا برشهای بافتی که توسط FITC و Annexin V فیکس شدهاند، بکار رود. تمایز بین سلولهای آپوپتوتیک و نکروتیک میتواند بوسیلهی رنگآمیزی همزمان با پروپیدیم یدید (PI) انجام گیرد. بنابراین آنکسینFITC-V (AnnexinV-FITC) به عنوان یک نشانگر در معرض فسفاتیدیل سرین و PI به عنوان یک نشانگر برای سلولهای مرده، مورد استفاده قرار میگیرد. بر این اساس و به منظور تعیین سلولهای آپوپتوزی و نکروزی در یک جمعیت سلولی تیمار شده با کمپلکس مورد مطالعه، رنگآمیزی سلولها با دو رنگ آنکسینFITC-V و پروپیدیم یدید (PI) انجام گرفت. تجزیه و تحلیل داده ها با بهره گرفتن از نرم افزار دستگاه و در پی تقسیمبندی یک منحنی دو بعدی آنکسینFITC-V در برابر پروپیدیم یدید (PI) به چهار ناحیهی Q1 تا Q4، صورت گرفت. در این تقسیم بندی ناحیهی Q1 نمایانگر سلولهای نکروزی با ویژگی آنکسینFITC-V، منفی و پروپیدیم یدید (PI)، مثبت؛ ناحیهی Q2 نمایانگر سلولهای آپوپتوزی تاخیری با ویژگی آنکسینFITC-V، مثبت و پروپیدیم یدید (PI)، مثبت؛ ناحیهی Q3 نمایانگر سلولهای سالم با ویژگی آنکسینFITC-V، منفی و پروپیدیم یدید (PI)، منفی؛ ناحیهی Q4 نمایانگر سلولهای آپوپتوزی اولیه با ویژگی آنکسینFITC-V، مثبت و پروپیدیم یدید (PI)، منفی؛ میباشند [۱۰۸].
بدین منظور رده های سلولی مختلف تیمار شده با کمپلکس مورد مطالعه، برای ۲۴ ساعت در یک غلظت نزدیک به IC50 در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از تیمار، سلولها توسط تریپسین برداشت شده و با سرعت ۱۰۰۰ دور در دقیقه (r.p.m.)، به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی (supernatant) برداشته شده و رسوب سلولی (cell pellet) در PBS، پس از آن، دو بار توسط بافر پیوندی (بایندیگ) (۱۰mM HEPES, 150mM NaCl, 5mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1mM MgCl2) شستشو داده شد. سلولها با یک آنتی بادی آنکسین V-FITC (5 میلی لیتر در ۱۰۰ میلی لیتر بافر اتصال) و در ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. نمونه ها در بافر پیوندی شسته شده و محلول رویی دور ریخته شد. رسوب سلولی در ۴۹۰ میلیلیتر بافر پیوندی و ۱۰ میلی‌لیتر پروپیدیم یدید (mg ml-1 10 در PBS) اضافه شد. فلوسایتومتری با بهره گرفتن از دستگاه فلوسایتومتر Partec PAS (Partec GmbH، آلمان) بر روی ترکیب مورد مطالعه و سیس پلاتین به عنوان مرجع صورت گرفت.
فصل۳
نتایج و بحث

 

۳-۱ مقدمه

 

کمپلکسهایی که اتم مرکزی آنها پلاتین است مانند سیس پلاتین و کربوپلاتین ترکیباتی مشهور هستند که ترکیب نخست، توسط روزنبرگ کشف شد و در درمان انواع سرطانها کاربرد دارند [۲۱]. در واقع اولین داروهایی که در زمینهی سرطان سنتز و مورد استفاده قرار گرفتند، داروهای پلاتینی هستند اما به علت عوارض جانبی زیاد از جمله سمیت کلیوی و اختلالات گوارشی، استفادهی درمانی آنها محدود شده است. لذا محققین به دنبال فلزات دیگری هستند تا بتوان با عوارض جانبی کمتر، جایگزین ترکیبات پلاتینی شوند. هر فلز بر اساس تعداد اتصالات، شکل هندسی، خواص سینتیکی، نحوهی اتصالات، حالت اکسیداسیون فلز و لیگاندهای اطراف، عملکرد بیولوژیکی متفاوتی روی انواع سرطانها ایجاد میکند.
ازجمله فلزات واسطه که کمپلکسهای تهیه شده از آنها دارای خواص ضدتوموری ویژهای میباشند میتوان به گالیم، قلع و تیتانیم اشاره نمود که در این کار مطالعاتی نیز مورد استفاده قرار گرفتهاند. تیتانیم حتی در دوزهای بالا، اثرات سمی کمتری دارد و مانند پلاتین اثرات زیانبار حاد در داخل بدن انسان ندارد. این ترکیب نسبت به سیس پلاتین از سمیت کمتری برخوردار است و بر روی سرطانهای روده بزرگ، ریه و PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) در فاز اول و دوم بالینی در سال ۱۹۹۳ مورد سنجش قرار گرفته است [۲۸-۲۴].
نحوهی ساز و کار ترکیبات تیتانوسن به عنوان یک عامل ضدسرطان هنوز مشخص نیست اما سادلر پیشنهاد کرد که این گونه قادر است به گروه فسفات DNA اتصال یابد و بتواند چرخهی سلولی را مهار کند. به همین جهت Ti4+ یک گزینهی بسیار عالی برای داروهای ضدسرطان بهشمار میآید [۲۹]. از معایب اصلی ترکیبات تیتانوسن که سبب میشود در فاز دوم بالینی فعالیت کمتری از خود نشان دهند، بیثباتی هیدرولیتیکی تحت شرایط فیزیولوژیکی است. این امر سبب شد تا دانشمندان به فکر ترکیب جدیدی از این فلز با ارزش باشند. به تازگی کمپلکس تیتانیم سالان با لیگاندهای چهار دندانه ONNO با داشتن خواص ضدسرطانی کشف شده است [۳۴]. یکی دیگر از کمپلکسهای تیتانیم استفاده از لیگاند مالتول میباشد. این کمپلکس غیرسمی است و در pH های اسیدی سنتز میشود.
در واقع همین عدم تقارن لیگاندهای متصل به تیتانیم، شرط ضروری برای داشتن یک فعالیت ضدتوموری است چرا که این نوع لیگاندها به فلز اجازه میدهند با هر زاویهی دلخواهی به سلول توموری هدف اتصال یابند [۳۶]. مهمترین هدف تیتانوسن سرطان کلیه است، اگر چه فعالیتهای قابل توجهی روی سرطان تخمدان، پروستات، رحم، ریه، PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) و روده بزرگ انجام شده است [۳۷].
گالیم دومین فلز واسطه بعد از پلاتین است که در زمینهی درمان سرطان مورد توجه است، که یکی از علل آن را میتوان به عدم فعالیت اکسیداسیون Ga3+ در محیط بیولوژیکی به حساب آورد [۴۶ و ۴۷]. هدف اصلی فلز گالیم آنزیمهای ردوکتاز ریبونوکلئوتید است که اختلال در عملکرد آنها سبب آپوپتوز میشود. ترکیبات دارویی گالیم مالتول برای اولین بار توسط لارنس برنشتاین کشف شد و اولین بار روی سرطان کبد به کار رفت و در فاز اول بالینی روی سرطان پروستات و مثانه، نتایج امید بخشی به دنبال داشت. نمکهای معدنی قلع دارای سمیت کمی هستند که از آن جمله میتوان به اکسیدهای قلع اشاره نمود که غیر سمی هستند. آنزیم تیوردوکسین، یک آنزیم هدف در سلولهای سرطانی است که مهار آن از عوامل مهم و جدید شیمی درمانی است. ترکیبات آلی قلع به عنوان عوامل ضدتوموری شناخته شدهاند [۸۵]. اثر مهارکنندگی آنزیم ردوکتاز توسط کمپلکسهای قلع توسط گروه تحقیقاتی دانشگاه فنی برانشویگ آلمان بررسی شد. ترکیبات آلی و معدنی قلع در شیمی درمانی سرطان در این چند سال اخیر جایگاه مهمی را باز کرده است.
در این کار مطالعاتی تلاش شده تا اثرات شگفتانگیز ضدتوموری کمپلکسهای فلزاتی چون تیتانیم، گالیم و قلع با لیگاندهایی مانند دفریپرون و مالتول روی رده های سلولیHeLa (کارسینومای تخمدان انسانی)، MCF-7 (سرطان سینه انسانی)، HT-29 (سرطان روده بزرگ انسانی)، K-562 (سرطان سلول‌های میلوییدی خون انسان) و Neuro-2a (نوروبلاستوما موشی) بررسی شود.

 

۳-۲ شناسایی کمپلکس (۱)

 

برطبق مطالبی که در فصل دوم بیان شد، این ترکیب از واکنش مقدارهای مولی از نمک نیترات گالیم با لیگاند
(۳-هیدروکسی-۲-متیل– ۴–پیران) با نسبت ۱ به ۳ در حلال آب و در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد تهیه شد (شکل ۳-۱).

 

شکل ۳-۱: ساختار کمپلکس [تریس (۳-هیدروکسی-۲-متیل–۴-هیدروژن-پیران–۴-اوناتو) گالیم (III)] (1)

 

 

۳-۲-۱ داده‌های تجزیه‌ی عنصری کمپلکس (۱)

 

دیدگاهتان را بنویسید