سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD، FTIR
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع
1-1- مقدمه
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی
فاکتور رشد فیبروبلاستی یا FGF (شکل 1) پروتئینی است که در بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر تقسیم سلولی، تکوین جنین، رگ زایی و بسیاری از فرآیندهای دیگر نقش دارد. به علاوه، این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم به محیط کشت سلولهای بنیادی جنینی انسانی اضافه می شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنیادینگی و بدون تمایز حفظ و تکثیر کرد (1).
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست
گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست(FGFR) در مسیر پیام رسانی سلول نقش کلیدی درتنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می کنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی و توسعه ی مراحل جنینی از جمله وظایفی هستند که در دوران جنینی و بزرگسالی در بدن توسط این گیرنده ها با اتصال به فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرم های موتاسیون یافته ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در سرطان های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.
شکل 1: نحوه عملکرد کلی FGF و .FGFR
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2
پروتئین نوترکیب FGFR2b (شکل2) متعلق به خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGFR) است. این پروتئین دارای 334 اسید آمینه و وزن مولکولی تقریبی 38 کیلودالتون می باشد. تغییرات ژنتیکی در این گیرنده با سرطان های اندومتریال، تخمدان و پستان در ارتباط می باشد. قابل ذکر است که نوع جهش یافته این گیرنده در تعدادی از سرطان ها گزارش شده است که با افزایش پیام مرتبط با این گیرنده در ارتباط می باشد(7).
در این پروتئین نوترکیب با انتقال الگوی موتاسیون مشاهده شده در گیرنده بیان شده در سلول سرطانی، فرم فعال و نوترکیب ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین FGFR2b ایجاد شده است که دارای جهش های مورد نظر می باشد. قابل ذکر است که تهیه ی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئینFGFR2b به صورت خالص این امکان را فراهم می کند که در مطالعات بعدی بتوان اطلاعاتی راجع به ساختار و نیز بررسی برهمکنش پروتئین و لیگاند از جمله اثر مهارکننده های مختلف را روی ناحیه ی کینازی این پروتئین به دست آورد.
بر این اساس در این تحقیق، تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش با فلزاتی که ذکر می شود، بررسی می گردد.
شکل 2: گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2.
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی
گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کینازی (شکل 3) هستند. این گیرنده ها دارای دو ایزو فرم b و cمی باشند که هرکدام به ترتیب در بافت های اپی تلیال و مزانشیمال بیان می شوند. هم چنین هفت گیرنده‏ در خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (شکل3) جای می گیرد که شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 می‏باشد(8). این گیرنده ها در مسیر پیام‏رسانی سلول نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می‏کنند (9). همه آن‏ها دارای یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی که خاصیت تیروزین کینازی دارد هستند. گیرنده ی FGFR2b ایزوفرم اپی تلیال گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی است. ناحیه ی کینازی FGFR2b متشکل از 334 اسیدآمینه می باشد و دارای ساختار به صورت دو ناحیه ی کینازی N-terminal و C-terminal است که توسط یک ناحیه ی اتصال دهنده انعطاف پذیر به هم مرتبط می شوند. این ناحیه ی اتصال دهنده حلقه ی فعال سازی نیز نامیده می شود که در عملکرد فسفریلاسیون تیروزین های ناحیه ی کیناز ی گیرنده نقش مهمی دارد. تقریبا %20 ژن‏های انسانی محصولاتی را کد می‏کنند که در مسیرهای پیام‏رسانی (سیگنالینگ) سلولی مشارکت دارند. تنظیم‏کننده‏های اصلی این مسیرها از طریق واکنش‏های فسفریلاسیون/ دفسفریلاسیون عمل می‏نمایند. آنزیم‏های تیروزین کیناز دسته‏ای از آنزیم‏ها هستند که مسئول فسفریلاسیون اسیدآمینه تیروزین روی پروتئین هدف خود هستند. دو خانواده از آنزیم‏های تیروزین کیناز وجود دارد که عبارتند از گیرنده های کینازی متصل به غشاء و کینازهای سیتوپلاسمی که گیرنده نیستند. ناحیه کاتالیتیکی از تیروزین کیناز شامل مکان اتصال به مولکول ATP ویژه و مکان اتصال به سوبسترا است (10).
الف)
ب)
شکل 3: الف) ساختمان کلی RTK. ب) انواع FGFR.
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون
جهش‏های نقطه‏ای در نواحی خارج سلولی، داخل غشایی و داخل سیتوپلاسمی باعث دایمریزیشن و یا اتوفسفریلیشن بدون ایجاد اتصال بین لیگاند و گیرنده می‏شوند. فعال‏سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون باعث فعالیت کینازی مداوم این آنزیم‏ها می‏شود. مکانیسم‏هایی که این موتاژنز آنزیمی را ایجاد می‏کنند شامل ترانس لوکشن کروموزومی یا موتاسیون های نقطه‏ای است که سبب تغییر در نواحی خارج سلولی، تغییر در ناحیه اتصال به ATP و تغییر در بخش کاتالیتیکی کیناز است. همه‏ی کینازها در فرم فعال از نظر کنفورماسیون شباهت زیادی با هم دارند در حالی که در فرم‏های غیر فعال از نظر ساختاری با یکدیگر متفاوت‏اند. آنکوژنیک تیروزین کینازها تنظیم فرآیندهای سلولی را مختل و یک فنوتیپ پاتولوژیک ایجاد می‏کنند، بنابراین به نظر می‏رسد که این پروتئین‏ها به عنوان یک هدف درمانی جالب توجه برای درمان سرطان باشند (11).
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق
درمطالعات انجام گرفته چندین جهش افزایش انتقال پیام در ناحیه ی کینازی FGFR2b در سرطان‏های اندومتریال، تخمدان و پستان شناسایی گردیده است. هم چنین مشخص شده است که اختلال تنظیمی مسیر پیام‏رسانی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی که می‏تواند ناشی از تغییرات ژنتیکی باشد با ایجاد سرطان ارتباط تنگاتنگی دارد (12). طبق مطالعات صورت گرفته، برخی فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، می توانند سبب اختلال در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و در نتیجه بروز بیماریهای متعددی شوند. یکی از سازوکارهایی که در ارتباط با اثر این ترکیبات روی رشد سلول‏های سرطانی مطرح می‏باشد اثر این ترکیبات بر روی مسیر انتقال پیام با واسطه تیروزین فسفریلاسیون می‏باشد (15-13). طبق دانش ما تاکنون برهمکنش FGFR2b KD با فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، در مطالعه ای گزارش نشده است. بر این اساس در این مطالعه تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b KD بر اثر برهمکنش با سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم با کمک تکنیک های اسپکتروسکوپی شامل فلوئورسانس، CD و FTIR بررسی می‏گردد.
1-3- اهداف طرح
1-3-1- هدف اصلی
بررسی بیان و تخلیص ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-2- اهداف فرعی
بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli.
تخلیص پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی.
بررسی تغییرات ساختاری پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.
1-3-3- اهداف کاربردی
مشخص شدن عوامل موثر در تغیییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان برخی سرطان ها و بیماری ها موثر باشد.
1-3-4- فرضیات
پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli بیان می شود.
پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص می شود.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با سرب تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با کادمیوم تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با نیکل تغییر می‏کند.
ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با آلومینیوم تغییر می‏کند.
1-3-5- متغییرها
عنوان متغیر
مستقل
وابسته
کمی
کیفی
تعریف علمی
مقیاس
پیوسته
گسسته
اسمی
رتبه ای
بیان پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
غلظت پروتئین
mg/ml
فلزات سمی
*
*
ppb
بررسی تغییر ساختار سوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک فلوئورسانس تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
Flourescence Intensity
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک پولاریزه تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
CD Spectropolarimeter
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b
*
*
تکنیک اسپکترومتر تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب
FTIR
cm-1
جدول 1: جدول متغیرها. متغیرهای مورد آزمایش، تعریف علمی هریک و مقیاس اندازه گیری آن ها.
فصل دوم مروری بر متون گذشته
2-1- پروتئین
پروتئینها ماکرومولکول هایی هستند که تمام اعمال مهم در ارگانیسم ها را انجام می دهند، از جمله این اعمال انجام واکنشهای بیوشیمیایی، انتقال مواد غذایی، تشخیص و انتقال پیامها است. بنابراین ژنها خزانه اطلاعات و پروتئینها ماشینهای حیات می باشند. پروتئینها از بهم پیوستن اسیدهای آمینه توسط پیوندهای پپتیدی به صورت یک زنجیره بوجود می آیند. پروتئینها از نظر طول زنجیره (از 30 تا بیش از 000/30 اسید آمینه) و همچنین ترتیب قرار گرفتن اسیدهای آمینه با هم متفاوت هستند.
پروتئین هایی که ما در طبیعت مشاهده می کنیم از طریق انتخاب طبیعی تکامل یافته اند تا عملی خاص را انجام دهند. عملکرد پروتئین ها به ساختار فضایی آنها بستگی دارد. اسیدهای آمینه که با ترتیبی خاص کنار هم قرار گرفته اند (ساختار اول) با پیچ و تاب خوردن در رو و کنار یکدیگر زیر واحدهایی را می سازند (ساختار دوم) که با استفاده از آنها ساختار فضایی پروتئین ساخته می شود(ساختار سوم) و حتی گاه چند واحد این چنینی با قرار گرفتن در کنار هم، خود ساختمان عظیم تری(ساختمان چهارم) را بوجود می آورند.
ساختمان پروتئین ها بطور تجربی بوسیله تکنیک های بلور نگاری پرتوی ایکس و رزنانس مغناطیسی هسته تعیین می شود. در طول 30 سال گذشته ساختمان بیش از 14000 پروتئین شناخته شده است و توالی بیش از 600000 پروتئین مشخص شده است. این موضوع حجم زیادی از اطلاعات را فراهم آورده است که می توان با استفاده از آنها اصول بنیادی ساختمان پروتئین ها را استنتاج کرد. این اصول درک چگونگی ایجاد ساختمان پروتئین ها، رابطه ساختمان و عمل و اساس ارتباط خویشاوندی بین پروتئین ها را آسان کرده است. علم ساختمان پروتئین در مرحله شناسایی و طبقه بندی است که در این مرحله ما میتوانیم اجزای شاخص و الگوها را در پروتئین هایی که ساختمان سه بعدی آنها تعیین شده است مشخص کنیم(17-16).
پروتئینها مواد آلی بزرگ و یکی از انواع درشت ‌مولکول‌های زیستی هستند که از زیر واحدهایی به نام اسید آمینه ساخته شده‌اند. پروتئین‌ها مانند زنجیری از یک کلاف سه‌بعدی هستند که از ترکیب اسیدهای آمینه حاصل می‌شوند. اسیدهای آمینه مثل یک زنجیر خطی توسط پیوند پپتیدی میان گروه‌های کربوکسیل و آمین مجاور ب

مطلب مشابه :  دانلود تحقیق در مورد ۱-۶-چرا، وپولمن,، (اسلیپر، سازندهی